Transcriptome على من التنميط<em> في الجسم الحي</em> إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
فقدان الجنينية المبكرة في الأبقار المنتجة العالية هي واحدة من التحديات الرئيسية في صناعة الالبان 1 و 2. أصبح الأبقار نموذج مثير للاهتمام لدراسة تطور سابق للانغراس الجنين الإنسان بسبب عملية تنموية مماثلة من 3 و 4. ومع ذلك، مطلوب مزيد من البحوث لدينا فهم أفضل عن جينات لها دور في التطور الجنيني المبكر البقري.
بعد عشرين عاما على تكنولوجيا متطورة للالأولى وضعت في عام 1995 5، وتطوير التكنولوجيا التحقيق تلفيق تقليل أخطاء الطباعة أكثر تطورا وتقلبه من رقائق مجموعة داخل وبين منصات ميكروأري مختلفة 6. وأسفرت تحسين تكنولوجيا متطورة في تطبيق على نطاق واسع لهذه التكنولوجيا في البحوث السريرية 7 و في الآونة الأخيرة، في ف الجنين في وقت مبكرتقييم ينشيء 8.
كمية كبيرة من المواد اللازمة لتكنولوجيا متطورة للهو السبب الرئيسي وراء فشل تكنولوجيا متطورة في البداية للدخول في عدد من المجالات البحثية مثل التطور الجنيني المبكر. وفي الآونة الأخيرة، تم تحسين أساليب RNA التضخيم لتضخيم خطيا RNA تصل إلى مستوى ميكروغرام من دون نانوغرام بدءا مادة RNA 9. هناك عدة مجموعات الحمض النووي الريبي التضخيم التجارية المتاحة في السوق. ومع ذلك، ترتبط أكثر شعبية في مجموعات متطورة لRIBO-واحدة التمهيدي متساوي التضخيم 10 و T7 المروج دفعت 11 الأساليب. يستخدم الأكثر شعبية التضخيم العقاقير الحمض النووي الريبي في النسخ المختبر مع جزئية DT التمهيدي ربط المروج T7 في "نهاية 12 5. وتسمح هذه التكنولوجيا الحفاظ على معظم النصوص مكافحة الشعور التمثيلية بعد الخطي التضخيم وأو صفائف التهجين 13. وقد تم تكييف هذا الأسلوب لتضخيم مستوى بيكو غرام من الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من الأبقار الجنين 8.
نظام الربط العالمي (ULS) هو طريقة وضع العلامات التي تضم بشكل مباشر على الحمض النووي الريبي أو تضخيم مع مرتبطة البلاتين صبغة الفلورسنت إما Cyanine 547 أو 647 Cyanine، من خلال تشكيل السندات التنسيقي على موقف N7 من جوانين 14. وقد تم تكييف هذه الطريقة في البحث الأجنة لتوليد أكثر استقرارا تضخيم آرنا دون تعديل بالمقارنة مع aminoallyl تعديل لآرنا الناتجة عن طريقة الأنزيمي 15. وقد تم تكييف أساليب كلا صبغ واحد واثنين من الأصباغ وصفها باستخدام نظام الربط العالمي في ميكروأري. وكانت دراسة مقارنات ميكروأري كبيرة أن هناك علاقة جيدة جودة البيانات بين منصات مجموعة واحدة وهما لونا 6.
في الآونة الأخيرة، على حد سواء T7 محرك المروجوقد تم تطوير أساليب ن العقاقير RNA التضخيم وULS وضع العلامات لتوفير بروتوكول أكثر موثوقية لتوليد كمية كافية من جودة عالية وصفت المواد آرنا لميكروأري التهجين 8 و 16. ولذلك، فإن هذه الدراسة على بروتوكول لإظهار بعض الخطوات الهامة من استخراج الحمض النووي الريبي لتحليل البيانات المشاركة في ميكروأري اللونين استخدام يوم واحد 7 أجنة الأبقار كمثال على ذلك.
Protocol
Representative Results
Discussion
المشكلة الأولى لأداء تحليل ميكروأري استخدام يوم واحد 7 أجنة الأبقار هو عدم الحصول على كميات كافية من الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية لدراسة التعبير الجيني. لا ينصح استخراج الحمض النووي الريبي الفينول التقليدي / الكلوروفورم وطريقة الإيثانول هطول الأمطار ليوم 7 الأ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
References
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- . Agilent 2100 Bioanalyzer User’s Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack) (2016)
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A., Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. , (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
