Transcriptome Profil<em> In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma> Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
Yüksek verimli sütçü sığırlarda erken embriyonik kayıp süt endüstrisi 1, 2 ana zorluklardan biridir. Sığır nedeniyle benzer gelişimsel süreç 3, 4 insan preimplantasyon embriyo gelişimini incelemek için ilginç bir model haline gelmiştir. Ancak, daha fazla araştırma sığır erken embriyonik gelişiminde rol oynayan genler hakkında daha iyi bir anlayış olması gerekir.
İlk mikrodizi teknolojisi bu yana yirmi yıl 1995 5 geliştirilen sonra daha sofistike prob üretim teknolojisi azaltılmış baskı hataları içinde ve farklı mikroarray platformları 6 arasında dizi yongalarının değişkenlik gelişimi. Geliştirilmiş mikrodizi teknolojisi erken embriyo q, son zamanlarda klinik araştırmalar 7 ve bu teknolojinin yaygın bir uygulama ile sonuçlanmıştıruality değerlendirmesi 8.
mikroarray teknolojisi için gerekli malzeme büyük miktarda mikroarray teknolojisi başlangıçta böyle erken embriyonik gelişme olarak araştırma alanları bir dizi giremedi ana nedeni olduğunu. Daha yakın zamanda, RNA amplifikasyon yöntemleri doğrusal RNA Başlangıç Maddesi 9 alt nanogram arasında mikrogram seviyesine kadar RNA amplifikasyonu için geliştirilmiştir. Piyasada bulunan birçok ticari RNA amplifikasyon kitleri vardır; Ancak, daha popüler iyi gelişmiş kitleri Ribo-Tek Primer İzotermal Amplification 10 ile ilgili ve T7 organizatörü 11 yöntemleri sürülür. En popüler antisens RNA amplifikasyonu 5 'ucunda 12 bir T7 promotörü bağlantılı bir oligo dT primeri ile in vitro transkripsiyonu ile kullanır. Bu teknoloji doğrusal amplifikasyon f sonra temsili bir anti-duyu transkript en muhafaza veriyorveya diziler melezleme 13. Bu yöntem, sığır embriyo 8 ekstrakte edilen toplam RNA pikogram seviyesini yükseltmek için adapte edilmiştir.
Evrensel Bağlantı Sistemi (ULS) doğrudan guanin 14 N7 pozisyonunda bir koordinatif bağ oluşturarak, platin bağlı flüoresan boya ya siyanin 547 veya cyanine 647 ile DNA veya RNA güçlendirilmiş içeren etiketleme yöntemidir. Bu yöntem, Arna enzimatik yöntem 15 tarafından üretilen tadil edilmiş aminoallyl göre değişiklik olmadan Arna amplifiye daha stabil oluşturmak için embriyolar araştırma uyarlanmıştır. Tek boya ve iki boyalar etiketleme Her iki yöntem mikroarray Evrensel Bağlantı Sistemi kullanılarak adapte edilmiştir. Büyük bir mikroarray karşılaştırmaları çalışma tek ve iki renkli dizisi platformları 6 arasındaki veri kalitesi iyi bir korelasyon olduğunu oldu.
Son zamanlarda, hem T7 yükseltici sürücün, antisens RNA amplifikasyonu ve uls etiketleme yöntemleri mikrodizi hibridizasyon 8, 16 için Arna malzeme etiketli yüksek kalitede yeterli miktarda üretmek için daha güvenilir bir protokol sağlamaktır geliştirilmiştir. Bu nedenle, bu çalışmada örnek olarak 7. Gün sığır embriyoları kullanılarak iki renkli mikroarray yer alan veri analizi RNA ekstraksiyon önemli adımlardan bazıları göstermek için bir protokol sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
İlk sorun gen ifadesinin çalışmak için yüksek kaliteli RNA yeterli miktarda almıyor Günlük 7 sığır embriyolarının kullanarak mikroarray analizi gerçekleştirmek için. Geleneksel fenol / kloroform RNA ekstraksiyonu ve etanol çökeltme yöntemi, düşük verim ve RNA amplifikasyon reaksiyonu inhibe olası artık fenol elde Gün 7 embriyo için uygun değildir. Bunun yerine, standart sütun tabanlı bir yöntem, toplam RNA izole etmek ve daha sonra konsantrasyonunu arttırmak için en az elüsyon tamponuyl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
References
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- . Agilent 2100 Bioanalyzer User’s Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack) (2016)
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A., Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. , (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
