Система впрыска под давлением для исследования Нейрофармакология обработки информации в Awake Behaving макаки Cortex
Summary
Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.
Abstract
The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.
Introduction
In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems).
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы подробно показано, как выполнить надежные и точные инъекции и высокое качество записи одноклеточных с "вне-шельф" впрыска под давлением системы. В то время как этот способ доставки лекарственных средств ранее использовалось в себя обезьян (обзор в 17), система , представленная здесь , имеет преимущества, рассмотренные ниже.
Как показано на фиг.4А, система , описанная здесь , может обеспечить стабильное измерение одной нейронной активности с использованием и без фармакологических инъекций в непосредственной близости от места записи. Как показано на фиг.4В, инъекция контрольного вещества, физиологический раствор, не приводило к изменению скорострельность. Этот контроль показывает, что сам процесс инъекции не оказывает ощутимого влияния на свойства теплотехнической записанных нейронов.
Пространственная конфигурация нейроне, записи электрода и микропипетки имеет решающее значение значение в этих экспериментах. Хотя точное измерение их относительных позиций в ткани во время записи не представляется возможным, мы можем рассмотреть и контроль за возможными источниками дисперсии. Во-первых, во время инъекции объема существует риск того, что нейрон интерес может быть смещен в сторону от регистрирующего электрода, влияя на стабильность записанных сигналов. По этой причине целесообразно сравнить скорострельность до и после блока впрыска для проверки стабильности сигнала. Во- вторых, конфигурация направляющей трубки системы регистрации определяет расстояние между электродами и микропипетки (например., 305 мкм в концентрической системе 3-канала , используемого в этом эксперименте). Поскольку система обеспечивает точное управление положением для глубины электродов и микропипетки в ткани, то расстояние между ними может быть сведено к минимуму путем тщательного калибровки относительную глубину до начала записи (этап 3.5), и держать их в общей глубине во время записи.
лор "> Потенциальные ограниченияВ дополнение к в доме контроля качества со стороны производителя, система должна быть подтверждена в лабораторных условиях, в качестве различных марок труб, шприцы и т.д. могут быть использованы и может привести к различиям в выбрасываемых объемов. Хотя система может быть использована для введения очень малых объемах, как в эксперименте, показанном здесь, это ниже минимального объема, который может быть проверен из-за практических ограничений измерения в нормальных лабораторных условиях. Тем не менее, большие объемы нагнетательных можно использовать для вывода соотношения между программируемыми параметрами объема и объема, выброшенного аппаратными средствами. Если используются прозрачные трубки, дополнительный визуальный контроль процесса впрыска возможно путем измерения смещения визуального маркера.
Вставка микропипетки в систему является более сложным, чем для вставки электродных, как диаметр микропипетки немного больше, и материал более хрупким. К тому же,присоединение трубки к контакту микропипетки является сложной задачей, поскольку это влечет за собой высокий риск разрыва верхней части микропипетки. Тем не менее, время жизни успешно загружен микропипетки несколько месяцев, даже при ежедневном использовании.
На практике мы еще не сталкивались с засорение в системе впрыска во время очистки после записи системы. Тем не менее, ни один "онлайн" проверка не возможно, и существует риск того, что физическое закупорка (например, ткани на кончике микропипетки), может предотвратить инъекции вещества. Поэтому было бы целесообразно проанализировать данные консервативно, в том числе таких, как только те клетки, в дальнейшем анализе, которые показывают значительные изменения в стрельбе скорости между контрольными и нагнетательных блоков эксперимента.
Несмотря на их малый диаметр, микроэлектродов и пипеток сместит ткани головного мозга и может вызвать некоторые местные повреждения тканей. Это может быть сведено к минимуму с помощью вручную позиционированием иглы ВЭС-е направляющие трубки непосредственно над твердой мозговой оболочки. Электроды затем проникают в твердую мозговую оболочку и их нетронутость выводится путем измерения их импедансы онлайн. После этого микропипетка вставляется. При использовании этого подхода, регулярное удаление ткани над твердой мозговой оболочки, рекомендуется, чтобы дополнительно уменьшить риск электрода или пипетка поломки.
Сравнение с альтернативными методами
Система, используемая здесь, показывает явные преимущества по сравнению с другими системами впрыска под давлением. Одним сильным преимуществом является диаметр микропипетки (приблизительно 100 мкм), что в два раза меньше других доступных зондов 17 и , следовательно , сводит к минимуму повреждение нервной ткани. В отличие от предыдущих конструкций, текущая система использует пространственно разнесены записи электрода и микропипетки. Хотя другие системы обеспечивают меньшее расстояние между электродом и пипетку, система, описанная здесь, позволяет независимые изменения глубины электродов и пипетку, таким образом пермипеременные относительные к раб расстояния в пределах сеанса записи. Важно отметить, что никаких компромиссов в отношении качества записи не должно быть сделано, поскольку система впрыска является продолжением установленного записывающего устройства. В то время как только один микропипетка и, таким образом, одно вещество используется в данном протоколе, можно вводить несколько веществ в пределах одной экспериментальной процедуры. Для достижения этой цели несколько микропипетки может быть ввинчен в отдельные направляющие трубки и подключены к шприцам, смонтированных в отдельных насосов впрыска. И, наконец, управление системой легко, так как только одна компьютерная программа необходима для продвижения электродов и микропипетки, а также для выполнения инъекции давления в ходе эксперимента.
Сравнивая давление впрыска для ионофореза, есть относительные преимущества и недостатки. Например, давление впрыска требует больших объемов, чтобы вводить в ткани, чем ионофорез, тем самым увеличивая риск нейронного смещения. Ток протоCol используются объемы в диапазоне Н.Л., и мы редко испытывали заметные изменения в качестве сигнала проведено заносимое клетки. Система также позволяет большие объемы для инъекций, который является потенциально полезным для поведенческих манипуляций, но может повлиять на стабильность нейронного записи. Явным преимуществом впрыска давления над ионофореза является большее разнообразие годные к употреблению веществ, так как не требуется использовать заряженные вещества. Однако значения рН должны быть проверены и сопоставлены между экспериментальными и контрольными веществами (например., Физиологический раствор).
Может возникнуть вопрос, почему использовать устоявшееся метод инъекции давления вместо новых методов, таких как оптогенетика для манипулирования нейронной активности. Хотя хорошо известно у грызунов, оптогенетика еще не достоверно установлено в макак-резусов. В частности, пока не позволяет локальную манипуляцию клеток селективным для определенного типа нейромедиаторов. В более долгосрочной перспективе, мы видим,большой потенциал для сочетания преимуществ фармакологических манипуляций с преимуществами optogentic манипуляций в выяснении нейронную основу когнитивных функций.
Здесь мы показали, как давление впрыска может быть использован для его фармакологически манипулировать локально ограниченную область в мозге бодрствования, ведут себя макак-резус. Мы надеемся, что этот метод вдохновляет других ученых исследовать neuromodulatory вклад в динамику активности нейронов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft через Научно-исследовательский центр "Collaborative 889 клеточных механизмов сенсорной обработки" на ST (Project C04). Мы благодарим Сина ПЛЮМЕР, Леонора Burchardt, Дирк Prüsse, Клаус Heisig и Ralf Brockhausen для технического и животных, связанных с поддержкой и наших соавторов в стволовой клетки группы немецкого Центра примата, д-р Катарина Debowski и Анны Magerhans, для оказания технической помощи в процесс фильтрации.
Materials
| (-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
| NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
| Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
| Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
| Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
| Deionized water | |||
| Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
| Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
| Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
| PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
| Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
| Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
| Minisart RC15 | Sartorius | 17761———-R | Syringe filter |
| Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
| McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |
References
- Noudoost, B., Moore, T. The role of neuromodulators in selective attention. Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).
- Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex. Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).
- Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area. J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).
- Thienel, R., et al. Muscarinic antagonist effects on executive control of attention. Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).
- Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics. Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).
- Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).
- Herr, N. R., Wightman, R. M. Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis. Front Biosci. 5, 249-257 (2013).
- Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings]. Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).
- Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery. Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).
- Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys. J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).
- Lalley, P. M., Johansson, H., Windhorst, U. . Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. , 193-209 (1999).
- Malpeli, J. G., Schiller, P. H. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).
- Dias, E. C., Segraves, M. A. A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys. J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).
- Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats. Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).
- Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex. Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).
- Association of Primate Veterinarians. . Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , (2015).
- Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex. Nature. 399, 575-579 (1999).
- Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex. Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).
