מערכת הזרקה בלחץ לחקירת neuropharmacology של עיבוד מידע Awake מתנהג מקוק קוף Cortex
Summary
Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.
Abstract
The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.
Introduction
In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems).
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו הדגמנו בפירוט כיצד לבצע זריקות אמינות ומדויקות והקלטות תא בודד באיכות גבוהה עם מערכת הזרקה בלחץ "ה- off- המדף". למרות ששיטה זו של אספקת סמים בעבר נעשתה שימוש מתנהג קופים (הנסקרת ב 17), המערכת הציגה יש כאן יתרונות, להלן סקירה.
כמו באיור 4 א, המערכת המתוארת כאן יכולה לספק מדידה יציבה של פעילות נוירון בודדת עם ובלי זריקות תרופתיות בסביבה הישירה של אתר ההקלטה. כפי שניתן לראות בתרשים 4 ב ', ההזרקה של שליטה בחומר, מלוח, לא להוביל לשינוי בירי שיעור. שליטה זו ממחישה כי תהליך ההזרקה עצם אין השפעה מדידה על נכסי הירי של נוירונים המוקלטים.
התצורה המרחבית של נוירון, אלקטרודה הקלטה, micropipette הוא של מכריע חשיבות בניסויים אלה. למרות מדידה מדויקת של עמדות ביחס שלהם בתוך הרקמה במהלך ההקלטה אינה אפשרית, אנחנו יכולים לשקול ובקרת מקורות אפשריים של שונות. ראשית, במהלך הזרקת נפח קיים סיכון כי הנוירון של עניין עשוי להיות שנעקר מן האלקטרודה ההקלטה, להם השלכה על איתנותו של אותות רשמו. מסיבה זו הוא פקח כדי להשוות את קצב הירי לפני ואחרי לחסום זריקה כדי לוודא את יציבותה אות. שנית, תצורת צינור מדריך של שיטת הרישום מגדירה את המרחק בין אלקטרודות micropipette (למשל., 305 מיקרומטר במערכת 3 ערוצים קונצנטריים השתמש בניסוי זה). כמו המערכת מספקת שליטה על מיקום מדויקת של עומק אלקטרודות micropipette בתוך הרקמה, המרחק ביניהם ניתן למזער על ידי כיול עומק ביחס בקפידה לפני ההקלטה (שלב 3.5), ושמירה על אותם בעומק נפוץ במהלך הקלטות.
אף אוזן גרון "> מגבלות פוטנציאליותבנוסף בקרת איכות ללא צורך במיקור חוץ על ידי היצרן, המערכת צריכה להיות מאומתת בתנאי מעבדה, כמו סוגים שונים של צינורות, מזרקים וכו 'יכולים לשמש עלול להוביל הבדלים בהיקפיים נפלט. למרות המערכת יכולה לשמש כדי להזריק כמויות קטנות מאוד כמו בניסוי המוצג כאן, אלה הם מתחת ההיקף המינימאלי שניתן תוקף בשל מגבלות מדידה מעשיות בסביבת מעבדה רגילה. עם זאת, כרכי הזרקה גדולים יכולים לשמש כדי להסיק את היחס בין הנפח מוגדר תוכנה בהיקף נפלט על ידי החומרה. אם צינורות שקופים משמשים, בדיקה חזותית נוספת של תהליך ההזרקה אפשרית על ידי מדידת התזוזה של סמן חזותי.
הכנסת micropipette לתוך המערכת היא יותר תובענית מאשר החדרת אלקטרודה, כמו הקוטר של micropipette הוא מעט גדול יותר ואת החומר הוא יותר שביר. בנוסף,הצטרפותו הצינור לפין של micropipette היא מאתגרת שכן יש בה סיכון גבוה לשבור את החלק העליון של micropipette. עם זאת, אורך החיים של micropipette נטען בהצלחה הוא מספר חודשים, אפילו עם לשימוש יומיומי.
בפועל, אנחנו עדיין לא נתקלנו סתימה במערכת ההזרקה במהלך הניקוי-הקלטת פוסט של המערכת. אף על פי כן, אין בדיקה "מקוונת" אפשרית, קיים סיכון כי חסימה פיזית (כגון רקמה על קצה micropipette) עשויה למנוע הזרקת חומר. זה יכול אפוא להיות רצוי לנתח את הנתונים באופן שמרני, כגון כולל רק אותם התאים לניתוח נוסף המראים שינויים משמעותיים ירי שיעורים בין בלוקים מלאי הזרקת הניסוי.
למרות הקוטר הקטן שלהם, microelectrodes ו טפטפות יתפוס את מקומו של רקמת המוח ועלול לגרום נזק לרקמות מקומיות. זה יכול להיות ממוזער באופן ידני על ידי צבת הקצה הדואר מדריך צינורות בדיוק מעל דורה מאטר. האלקטרודות ואז לחדור הדורה התקינה שלהם הוא להסיק על ידי מדידת העכבות שלהם באינטרנט. לאחר מכן, micropipette מוכנס. בעת השימוש בגישה זו, הסרה קבועה של רקמה מעל הדורה מומלצת לצמצם עוד יותר את הסיכון של שבירת אלקטרודה או טפטף.
השוואה לשיטות חלופיות
המערכת המשמשת כאן מראה יתרונות ברורים בהשוואה למערכות הזרקה בלחץ אחרות. יתרון חזק אחת הוא בקוטר של micropipette (כ 100 מיקרומטר), אשר הוא חצי בגודל של בדיקות זמינות אחרות 17 ולכן ממזער את ניזק רקמה עצבי. בניגוד עיצובים קודמים, המערכת הנוכחית מעסיקה מופרדים מרחבית אלקטרודה הקלטה micropipette. בעוד שמערכות אחרות לספק מרחק קטן יותר בין האלקטרודה פיפטה, המערכת המתוארת כאן מאפשרת שינויי עומק עצמאיים של אלקטרודות פיפטה, ובכך permitting מרחקים יחסיים משתנים בתוך הקלטות. חשוב לציין, ללא פשרות לגבי איכות הקלטה צריכה להיעשות, כמו מערכת ההזרקה הוא רחבה של מכשיר הקלטה הוקם. בעוד רק micropipette אחד ובכך חומר אחד משמש פרוטוקול זה, אפשר להזריק מספר חומרים בתוך הליך ניסיוני אחד. כדי להשיג זאת, כמה micropipettes ניתן מושחל לתוך צינורות מדריך נפרדים ומחובר המזרקים רכובי משאבות הזרקת פרט. לבסוף, שליטה על המערכת קלה, כמו שרק תוכנת מחשב אחד נדרשה כדי לקדם את אלקטרודות micropipette, וכדי לבצע את ההזרקה בלחץ במהלך הניסוי.
השוואת הזרקה בלחץ כדי iontophoresis, יש יתרונות וחסרונות יחסיים. לדוגמא, הזרקה בלחץ דורשת כמויות יותר יוכנסו הרקמה מ iontophoresis, ובכך מגדיל את הסיכון של עקירה עצבית. פרוטו הנוכחיcol בשימוש כרכים בטווח NL, ואנחנו כמעט ולא חווינו שינויים מורגשים בתוך איכות האות של תא מוקלט. המערכת גם מאפשרת נפחים גדולים יותר להיות מוזרקים, וזה שימושי פוטנציאלי עבור מניפולציות התנהגותיות אבל יכול להשפיע על יציבות של הקלטה עצבית. יתרון ברור של הזרקה בלחץ מעל iontophoresis הוא המגוון הגדול יותר של חומרים שמישים כמו אין דרישה להשתמש בחומרים טעונים. עם זאת, ערכי ה- pH צריכים להיבדק ומשווים בין חומרים ניסיוניים ובקרה (למשל., מלוח).
השאלה שעלולה להתעורר למה להשתמש בשיטה הוותיקה של הזרקה בלחץ במקום טכניקות חדשות יותר כגון optogenetics מניפולצית פעילות עצבית. למרות וותיקה במכרסמים, optogenetics כי לא נקבע עדיין מהימן בקופי רזוס. בפרט, זה אינו מאפשר המניפולציה המקומית של תאים סלקטיבי לסוג הנוירוטרנסמיטר בפרט. בטווח הארוך יותר, אנו רואיםפוטנציאל גדול עבור שילוב היתרונות של מניפולציות תרופתיות עם היתרונות של מניפולציות optogentic הבהרת הבסיס העצבי של תפקודים קוגניטיביים.
הנה הראינו כיצד הזרקה בלחץ יכולה לשמש פרמקולוגית לתפעל אזור מקומי מוגבל במוח של ער, מתנהגת קופי רזוס. אנו מקווים כי שיטה זו מעניקה השראה למדענים אחרים כדי לחקור תרומות neuromodulatory לדינמיקה של פעילות עצבית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft דרך מרכז שיתופי מחקר 889 "המנגנונים התאיים של בעיבוד החושי" ל- ST (פרויקט C04). אנו מודים סינא פלומר, לאונור Burchardt, דירק Prüsse, קלאוס Heisig ואת ראלף Brockhausen לתמיכה טכנית חיה הקשורות ומשתפי הפעולה שלנו ביחידה תאי גזע של מרכז הפרימאטים הגרמני, ד"ר קתרינה Debowski ואנה Magerhans עבור סיוע טכני תהליך סינון.
Materials
| (-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
| NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
| Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
| Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
| Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
| Deionized water | |||
| Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
| Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
| Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
| PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
| Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
| Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
| Minisart RC15 | Sartorius | 17761———-R | Syringe filter |
| Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
| McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |
References
- Noudoost, B., Moore, T. The role of neuromodulators in selective attention. Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).
- Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex. Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).
- Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area. J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).
- Thienel, R., et al. Muscarinic antagonist effects on executive control of attention. Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).
- Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics. Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).
- Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).
- Herr, N. R., Wightman, R. M. Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis. Front Biosci. 5, 249-257 (2013).
- Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings]. Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).
- Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery. Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).
- Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys. J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).
- Lalley, P. M., Johansson, H., Windhorst, U. . Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. , 193-209 (1999).
- Malpeli, J. G., Schiller, P. H. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).
- Dias, E. C., Segraves, M. A. A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys. J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).
- Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats. Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).
- Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex. Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).
- Association of Primate Veterinarians. . Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , (2015).
- Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex. Nature. 399, 575-579 (1999).
- Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex. Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).
