Uyanık Davranan Macaque Maymun Korteks Bilgi İşlem Neuropharmacology araştırılması için Bir Basınç Enjeksiyon Sistemi
Summary
Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.
Abstract
The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.
Introduction
In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems).
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bir "off-the-raf" basınçlı enjeksiyon sistemi ile güvenilir ve hassas enjeksiyon ve yüksek kaliteli tek hücreli kayıtları nasıl gerçekleştirileceği detaylı olarak tarif var. Ilaç verme yöntemi, daha önce (17 gözden) maymunlar davranıyor kullanılmış olsa da, burada sunulan sistem aşağıda gözden avantajları vardır.
Şekil 4A'da gösterildiği gibi, burada tarif edilen sistem ile ve kayda hemen yanında farmakolojik enjeksiyonlar olmadan tek bir nöron aktivitesi sabit ölçüm sağlar. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, bir kontrol maddesi, tuzlu su enjeksiyonu, ateşleme hızı bir değişikliğe yol açmadı. Bu kontrol, enjeksiyon işleminin kendisi kayıt nöronların ateşleme özellikleri üzerinde ölçülebilir bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.
nöron, kayıt elektrot ve mikropipet mekansal yapılandırma önemli biridir Bu deneylerde önemi. Kayıt sırasında dokuda göreceli konumlarının kesin bir ölçü mümkün olmasa da, biz düşünün ve varyans olası kaynakları kontrol edebilirsiniz. İlk olarak, hacim, enjeksiyon sırasında ilgi nöron kaydedilen sinyallerin dengesini etkilemeden, kayıt elektrot uzak değiştirilebilmeleri riski vardır. Bu nedenle daha önce ve sinyal kararlılığını doğrulamak için enjeksiyon bloğundan sonra atış hızına karşılaştırmak için isabetli olmuştur. İkinci olarak, kayıt sisteminin kılavuz borusu konfigürasyonu elektrotları ve mikropipet arasındaki mesafeyi tanımlar (örn., Bu deneyde kullanılan eş-3-kanallı sistemde 305 um). Sistem dokusunda elektrotlar ve mikropipet derinliği hassas pozisyon kontrolü sağlar gibi, aralarındaki mesafe dikkatlice (adım 3.5) Kayıttan önce nispi derinlik kalibre ve kayıtları sırasında ortak bir derinlikte tutarak minimize edilebilir.
ent "> Potansiyel sınırlamalarüretici tarafından in-house kalite kontrolüne ek olarak, sistem tüplerin farklı marka olarak, laboratuvar koşullarında valide gerekiyor, vb şırıngalar kullanılabilir ve atılır hacimlerde farklılıklara yol açabilir. Sistem burada gösterilen deneyde olduğu gibi, çok küçük hacimlerde enjekte etmek için kullanılabilir olsa da, bu, normal bir laboratuvar ortamında uygulama ölüm sınırlarına bağlı olarak doğrulanabilir, minimum hacimde altında bulunmaktadır. Bununla birlikte, daha büyük bir enjeksiyon hacimleri yazılımla tanımlanmış miktar ve donanım tarafından püskürtülen hacmi arasındaki ilişkiyi belirlemek için de kullanılabilir. Şeffaf borular kullanıldığında, enjeksiyon işleminin ek bir görsel kontrol görsel işaretin yer değiştirme ölçümü mümkündür.
Mikropipet çapı biraz daha büyüktür ve malzeme daha kırılgan olduğu gibi sisteme mikropipet yerleştirilmesi, elektrot yerleştirilmesi daha talep ediyor. Ek olarak,o mikropipet üst kısmını kırılma riski yüksek gerektirir olarak mikropipet pin tüp katılmadan zordur. Ancak, başarılı bir şekilde yüklendi mikropipet ömrü bile günlük kullanım ile, birkaç aydır.
Uygulamada, henüz sistemin post-kayıt temizliği sırasında enjeksiyon sisteminde bir tıkanıklık karşılaşmadım. Bununla birlikte, hiçbir "çevrimiçi" onay mümkündür ve (örneğin, mikropipet ucunda doku gibi) fiziksel tıkanma madde enjeksiyonu engelleyebilecek bir riski vardır. Nedenle bu tür bir deney kontrolü ve enjeksiyon blokları arasında fiyat ateş önemli değişiklikler gösteren daha fazla analiz yalnızca bu hücreler de dahil olmak üzere gibi konservatif verileri analiz etmek için tavsiye edilebilir.
kendi küçük çaplı olmasına rağmen, Mikroelektronlar ve pipetler beyin dokusu yerinden edecek ve bazı lokal doku hasarına neden olabilir. Bu el th ucu konumlandırmak minimize edilebilirsadece dura mater üzerinde e kılavuz tüpleri. elektrotlar daha sonra dura nüfuz ve intakt çevrimiçi olarak empedans ölçerek anlaşılmaktadır. Daha sonra, mikropipet eklenir. Bu yaklaşım kullanıldığında, dura üzerinde doku normal uzaklaştırılması, daha fazla elektrod veya pipet kırılma riskini azaltmak için tavsiye edilir.
Alternatif yöntemlere karşılaştırması
Burada kullanılan sistem, diğer basınçlı enjeksiyon sistemleri ile karşılaştırıldığında net avantajlar gösterir. Güçlü bir avantajı, diğer mevcut problar 17 yarısı kadardır mikropipet (yaklaşık 100 um), çapı ve dolayısıyla nevral doku hasarını en aza indirir. önceki tasarımlara aksine, mevcut sistem uzamsal kayıt elektrot ve mikropipet ayrılır çalışmaktadır. Diğer sistemler, elektrot ve pipet arasında küçük bir mesafe temin olsa da, burada açıklanan sistem elektrotlar ve pipet böylece PERMI bağımsız derinliği değişiklikleri sağlarBir kayıt oturumu içinde değişken izafi mesafeleri tting. Enjeksiyon sistemi, esaslı bir kayıt cihazının bir uzantısı olarak da önemlisi, kayıt kalitesi ile ilgili olarak herhangi bir uzlaşma yapılması gerekmektedir. Sadece bir Mikropipet ve böylece bir madde bu protokolde kullanılan iken, bir deneysel prosedür içinde birden fazla madde enjekte etmek mümkündür. Bunu başarmak için, birden fazla mikropipetler ayrı kılavuz tüp içine dişli ve bireysel püskürtme pompalarında monte iğneleri bağlanabilir. Sadece bir bilgisayar programı elektrotlar ve mikropipet ilerlemek için, ve deney sırasında basınç enjeksiyon gerçekleştirmek için gerekli Son olarak, kontrol sistemi, kolay.
iyontoforez basınç enjeksiyon karşılaştırıldığında, göreli avantajları ve dezavantajları vardır. Örneğin, basınçlı enjeksiyon böylece nöronal deplasman riskini artıran, iyontoforez daha dokuya tanıtılan büyük hacimli gerektirir. geçerli protocol nL aralığında hacimleri kullanılan ve nadiren bir kayıtlı hücrenin sinyal kalitesinde gözle görülür değişiklikler yaşadı. Sistem aynı zamanda, davranışsal manipülasyonlar için potansiyel olarak yararlı olan, ancak nöronal kayıt stabilitesini etkileyebilecek olan daha büyük hacimler enjekte edilmesini sağlar. yüklü maddeleri kullanmak için hiçbir zorunluluk olmadığından dolayı iyontoforez üzerindeki basınç enjeksiyon net bir avantajı kullanılabilir maddelerin büyük çeşididir. Ancak, pH değerleri kontrol edilmeli ve deney ve kontrol maddeler arasında karşılaştırıldı (örn., Tuz).
soru nöral aktiviteyi işlemek için böyle optogenetics olarak yerine yeni tekniklerin basınçlı enjeksiyon köklü yöntemi kullanmak neden ortaya çıkabilir. iyi kemirgenlerde kurulmuş olmasına rağmen, optogenetics henüz güvenilir bir rhesus maymunları kurulmuş değildir. Özel olarak, henüz bir nörotransmitter türü için seçici olan hücrelerin lokal manipülasyon izin vermez. uzun vadede, görüyoruzbilişsel işlevlerin nöral temelini durulaştırmada optogentic manipülasyonlar avantajları ile farmakolojik manipülasyonlar avantajları kombinasyonu için büyük bir potansiyel.
Burada basınçlı enjeksiyon rhesus maymunlarının davranmak, farmakolojik uyanık beynindeki bir yerel sınırlı alanı işlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermiştir. Biz bu yöntem nöronal aktivitenin dinamiklerine nöromodülatör katkıları araştırmak için diğer bilim adamları ilham umuyoruz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser ST "Duyu İşleme Hücresel Mekanizmaları" İşbirlikçi Research Center 889 (Proje C04) aracılığıyla Deutsche Forschungsgemeinschaft hibe ile desteklenmiştir. Biz teknik yardım için, Alman primat Merkezi'nde, Dr. Katharina Debowski ve Anna Magerhans ve Kök Hücre Ünitesi Sina Plümer, Leonore Burchardt, Dirk Prusse Klaus Heisig teknik ve hayvansal ilgili destek için Ralf Brockhausen ve işbirlikçileri teşekkür filtrasyon işlemi.
Materials
| (-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
| NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
| Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
| Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
| Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
| Deionized water | |||
| Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
| Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
| Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
| PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
| Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
| Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
| Minisart RC15 | Sartorius | 17761———-R | Syringe filter |
| Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
| McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |
References
- Noudoost, B., Moore, T. The role of neuromodulators in selective attention. Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).
- Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex. Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).
- Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area. J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).
- Thienel, R., et al. Muscarinic antagonist effects on executive control of attention. Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).
- Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics. Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).
- Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).
- Herr, N. R., Wightman, R. M. Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis. Front Biosci. 5, 249-257 (2013).
- Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings]. Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).
- Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery. Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).
- Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys. J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).
- Lalley, P. M., Johansson, H., Windhorst, U. . Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. , 193-209 (1999).
- Malpeli, J. G., Schiller, P. H. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).
- Dias, E. C., Segraves, M. A. A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys. J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).
- Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats. Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).
- Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex. Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).
- Association of Primate Veterinarians. . Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , (2015).
- Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex. Nature. 399, 575-579 (1999).
- Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex. Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).
