In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS
Summary
Diese Arbeit stellt ein Protokoll für die Flüssigkeitshandhabung und Probenaufgabe zu einem Mikrokanal zur in situ-Time-of-Flight-Sekundärionen-Massenspektrometrie-Analyse von Protein Biomolekülen in einer wässrigen Lösung.
Abstract
Diese Arbeit zeigt, in-situ-Charakterisierung von Protein Biomolekülen in der wässrigen Lösung in dem Liquid Vacuum-Schnittstelle des Systems für die Analyse unter Verwendung von (SALVI) und Time-of-Flight-Sekundärionenmassenspektrometrie (TOF-SIMS). Die Fibronektin Proteinfilm wurde auf dem Siliziumnitrid (SiN), die die Membran immobilisiert SALVI Erfassungsbereich bildet. Während ToF-SIMS-Analyse wurden drei Arten der Analyse durchgeführt, einschließlich hoher räumlicher Auflösung Massenspektrometrie, zweidimensionale (2D) Bildgebung und Tiefenprofilierung. Massenspektren wurden im positiven und negativen Modus erworben. Entionisiertes Wasser wurde als Referenzprobe analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fibronektin Film in Wasser hat deutlicher und stärker Spitzen Wassercluster zu Wasser allein verglichen. Charakteristische Peaks von Aminosäure-Fragmente sind ebenfalls zu beobachten in der hydratisierten Protein TOF-SIMS-Spektren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Proteinmolekül Adsorption an einer Oberfläche dynamica sucht werden könnenlly Verwendung SALVI und ToF-SIMS in der flüssigen Umgebung zum ersten Mal.
Introduction
Hydratation ist entscheidend für die Struktur, Konformation 1, 2 und 3 der biologischen Aktivität von Proteinen. Proteine ohne Wassermoleküle um sie herum wäre nicht lebensfähig biologischen Aktivitäten haben. Genauer gesagt, interagieren Wassermoleküle mit der Oberfläche und die innere Struktur von Proteinen und verschiedenen Hydratationszustände von Proteinen machen solche Wechselwirkungen deutlich. 4 Die Wechselwirkung von Proteinen mit festen Oberflächen ist ein grundlegendes Phänomen mit Auswirkungen im Bereich der Nanotechnologie, Biomaterialien und Prozesse Tissue Engineering. Studien haben darauf hingewiesen, dass lange Konformationsänderungen eintreten können als ein Protein mit einer Oberfläche trifft. ToF-SIMS wurde als ein Verfahren, vorgesehen, dass das Potenzial, die Protein-fest-Grenzfläche zu untersuchen hat. 5-7 ist es wichtig, die Hydratation von Proteinen auf festen Oberflächen zu verstehen, die möglicherweise ein grundlegendes Verständnis des Mechanismus ihrer Struktur liefert, Konformation und biologischeal Aktivität.
Allerdings sind große Oberflächenanalysetechniken meistens vakuumbasierten und direkte Anwendungen für flüchtige Flüssigkeit Studien sind schwierig aufgrund der raschen Verdampfung der flüchtigen Flüssigkeit unter der Vakuumumgebung. Wir entwickelten ein Vakuum kompatibel mikrofluidische Schnittstelle, System zur Analyse auf dem Liquid Vacuum Interface (SALVI), direkte Beobachtungen von Flüssigkeitsoberflächen und Flüssig-Fest-Interaktionen zu ermöglichen mit Time-of-Flight-Sekundärionenmassenspektrometrie (TOF-SIMS). 8- 11 die einzigartigen Aspekte schließen die folgenden ein: 1) das Detektionsfenster eine Öffnung von 2-3 um im Durchmesser direkte Abbildung der Flüssigkeitsoberfläche ermöglicht, 2) Oberflächenspannung wird die Flüssigkeit in der Öffnung zu halten, und 3) ist SALVI tragbaren zwischen mehreren Analyseplattformen. 11,12
SALVI besteht aus einem Siliziumnitrid (SiN) Membran als dem Erfassungsbereich und einem Mikrokanal aus Polydimethylsiloxan (PDMS). Es ist fabrcated im Reinraum, und die Herstellung und die wichtigsten Designfaktoren wurden in früheren Veröffentlichungen und Patenten ausführlich dargestellt. 8-12 Die Anwendungen der TOF-SIMS als analytisches Werkzeug wurden gezeigt, eine Vielzahl von wässrigen Lösungen und komplexen Flüssigkeitsmischungen verwenden, einige der die Nanopartikel enthalten. 13-17 Insbesondere SALVI Flüssigkeit TOF-SIMS ermöglicht der flüssig-Fest-Grenzfläche von lebenden biologischen Systemen Rammsondierung (dh Biofilme), Einzelzellen und Festelektrolyt-Schnittstelle, für neue Möglichkeiten öffnen in situ kondensierten Phase Studien einschließlich Flüssigkeiten TOF-SIMS verwenden. Allerdings ist der aktuelle Entwurf noch nicht Gas-Flüssigkeits-Interaktionen ermöglichen. Dies ist eine Richtung für die zukünftige Entwicklung. SALVI wurde verwendet, um den hydratisierten Proteinfilm in dieser Arbeit zum ersten Mal zu studieren.
Fibronectin ist ein häufig verwendetes Protein-Dimer, bestehend aus zwei nahezu identischen Monomeren durch ein Paar Disulfidbindungen verbunden sind, 18, die is für seine Fähigkeit, bekannte Zellen zu binden. 19,20 Sie als Modellsystem ausgewählt wurde zu veranschaulichen, dass die hydrierten Proteinfilm dynamisch die SALVI Flüssigkeit mit TOF-SIMS Ansatz untersucht werden konnte. Die Proteinlösung wurde in den Mikrokanal eingeführt. Nach Inkubation für 12 Stunden, ein hydratisiertes Proteinfilm auf der Rückseite des SiN-Membran gebildet. Deionisiertes Wasser (DI) wurde verwendet, um den Kanal nach der Protein Einführung abzuspülen. Die Informationen wurden in der SALVI Mikrokanal mit dynamischen TOF-SIMS aus hydrierten Fibronektin Proteinmolekülen gesammelt. DI-Wasser wurde ebenfalls als Kontrolle untersucht mit den Ergebnissen aus hydrierten Fibronektin Dünnschicht erhalten zu vergleichen. Deutliche Unterschiede zwischen dem hydratisierten Proteinfilm und DI-Wasser beobachtet. Diese Arbeit zeigt, dass die Proteinadsorption an der Oberfläche in der flüssigen Umgebung können mit dem neuartigen SALVI und Flüssigkeit TOF-SIMS Ansatz untersucht werden. Die Video-Protokoll ist für den Menschen eine technische Anleitung zur Verfügung zu stellen, die daran interessiert sindin diese neue Analysewerkzeug für vielfältige Anwendungen von SALVI mit TOF-SIMS zu nutzen und unnötige Fehler in Liquid Handling sowie TOF-SIMS Datenerfassung und -analyse zu reduzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI ist ein Mikrofluidik-Schnittstelle, die durch Vakuumbasierte Instrumente, wie TOF-SIMS und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) dynamische Flüssigkeitsoberfläche und Flüssig-Fest-Schnittstellenanalyse ermöglicht. Durch die Verwendung von kleinen Öffnungen Flüssigkeit auszusetzen direkt im Vakuum, ist SALVI für viele fein fokussierten Spektroskopie und bildgebenden Verfahren ohne Änderungen; 22 die Portabilität und Flexibilität der Mikrofluidik es eine echte multimodale Bildgebungsplattform machen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
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