In Situ Caratterizzazione di idrate proteine in acqua da Salvi e TOF-SIMS
Summary
Questo lavoro presenta un protocollo di gestione dei liquidi e di introduzione del campione ad un microcanali per in situ tempo di volo ioni secondari analisi di spettrometria di massa di biomolecole proteina in una soluzione acquosa.
Abstract
Questo lavoro dimostra in situ caratterizzazione di biomolecole di proteine nella soluzione acquosa utilizzando il sistema per l'analisi al Interface Vacuum Liquid (SALVI) e tempo di volo spettrometria di massa di ioni secondari (TOF-SIMS). Il film proteine fibronectina è stato immobilizzato sulla membrana di nitruro di silicio (SiN) che forma l'area di rilevamento SALVI. Durante l'analisi ToF-SIMS, sono stati condotti tre modalità di analisi compreso alta spettrometria di massa spaziale risoluzione, immagini bidimensionali (2D), e profili di profondità. Gli spettri di massa sono stati acquisiti in entrambe le modalità positivi e negativi. acqua deionizzata è stato anche analizzato come un campione di riferimento. I nostri risultati mostrano che il film fibronectina in acqua ha più distinti e più forti picchi di cluster di acqua rispetto alla sola acqua. picchi caratteristici di frammenti di amminoacidi sono anche osservabili nella proteina idratata ToF-SIMS spettri. Questi risultati dimostrano che molecola proteica adsorbimento su una superficie può essere studiato Dynamically usando Salvi e ToF-SIMS nell'ambiente liquido per la prima volta.
Introduction
L'idratazione è cruciale per la struttura, 1 conformazione, 2 e 3 attività biologica delle proteine. Le proteine senza molecole d'acqua che li circondano non avrebbero attività biologiche vitali. In particolare, le molecole d'acqua interagiscono con la superficie e la struttura interna delle proteine, e diversi stati di idratazione di proteine rendono tali interazioni distinte. 4 L'interazione delle proteine con le superfici solide è un fenomeno fondamentale, con implicazioni nel campo delle nanotecnologie, biomateriali e processi di ingegneria tissutale. Studi hanno a lungo indicato che i cambiamenti conformazionali possono verificarsi come proteina incontra una superficie. ToF-SIMS è stato concepito come la tecnica che ha il potenziale per studiare all'interfaccia proteina-solido. 5-7 È importante comprendere l'idratazione di proteine su superfici solide, che fornisce potenzialmente una comprensione fondamentale del meccanismo della loro struttura, conformazione e biological'attività al.
Tuttavia, le tecniche analitiche superficie maggiore sono per lo più sotto vuoto-based e applicazioni dirette per Studi liquidi volatili sono difficili a causa della rapida evaporazione del liquido volatile in ambiente sottovuoto. Abbiamo sviluppato un vuoto un'interfaccia microfluidica compatibile, sistema per l'analisi presso l'interfaccia Vacuum Liquid (SALVI), per consentire osservazioni dirette di superfici liquide e interazioni liquido-solido che utilizzano tempo di volo di ioni secondari spettrometria di massa (TOF-SIMS). 8- 11 Gli aspetti unici sono i seguenti: 1) la finestra di rilevamento è un'apertura di 2-3 micron di diametro che permette l'imaging diretto della superficie del liquido, 2) tensione superficiale è utilizzato per contenere il liquido all'interno del diaframma, e 3) Salvi è portatile tra più piattaforme analitiche. 11,12
Salvi è composto da una membrana di nitruro di silicio (SiN) come area di rilevamento e un microcanale in polidimetilsilossano (PDMS). E 'fabricated nella stanza pulita, ei fattori di fabbricazione e di progettazione chiave sono stati dettagliatamente nei precedenti documenti e brevetti. 8-12 Le applicazioni di ToF-SIMS come strumento analitico sono state dimostrate utilizzando una varietà di soluzioni acquose e le miscele di liquidi complessi, alcuni dei che conteneva le nanoparticelle. 13-17 in particolare, SALVI liquido TOF-SIMS consente dinamica sondare l'interfaccia liquido-solido dei sistemi live biologici (ad esempio, biofilm), celle singole, e l'interfaccia solido-elettrolitico, aprendo nuove opportunità per in situ condensato fase studi, tra cui liquidi con l'ausilio TOF-SIMS. Tuttavia, il design attuale non consente ancora interazioni gas-liquido. Questa è una direzione per lo sviluppo futuro. SALVI è stato utilizzato per studiare il film proteina idrata in questo lavoro per la prima volta.
Fibronectina è un dimero proteine comunemente usato, costituito da due monomeri quasi identici collegati da una coppia di ponti disolfuro, 18 che is ben noto per la sua capacità di legare le cellule. 19,20 E 'stato scelto come sistema modello per illustrare che il film proteina idratata potrebbe essere sondato in modo dinamico con il liquido SALVI ToF-SIMS approccio. La soluzione proteica è stata introdotta nel microcanali. Dopo incubazione per 12 ore, un film proteina idratata formata sul lato posteriore della membrana SiN. Deionizzata (DI) l'acqua è stata utilizzata per risciacquare il canale dopo l'introduzione di proteine. Le informazioni sono state raccolte da idrati molecole di proteine fibronectina nel microcanali SALVI usando dinamica TOF-SIMS. DI acqua è stato studiato anche come controllo da confrontare con i risultati ottenuti da idratato film sottile fibronectina. sono state osservate differenze distinte tra il film proteina idratata e acqua deionizzata. Questo lavoro dimostra che l'assorbimento di proteine sulla superficie in ambiente liquido può essere studiato con il romanzo Salvi e liquido approccio ToF-SIMS. Il protocollo video è destinato a fornire una guida tecnica per le persone che sono interessatead utilizzare questo nuovo strumento di analisi per le diverse applicazioni di SALVI con ToF-SIMS e ridurre gli errori inutili in gestione dei liquidi, nonché l'acquisizione di dati ToF-SIMS e l'analisi.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI è un'interfaccia microfluidico che consente superficie del liquido dinamico e analisi interfaccia liquido-solido da strumenti vuoto based, come ToF-SIMS e microscopia elettronica a scansione (SEM). A causa l'utilizzo di piccole aperture per esporre il liquido direttamente nel vuoto, SALVI è adatto per molte spettroscopia e di imaging tecniche finemente focalizzato, senza alcuna modifica; 22 la portabilità e la versatilità di microfluidica ne fanno una vera e propria piattaforma di imaging mu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
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