La caractérisation in situ des protéines hydratés dans l'eau par Salvi TOF-SIMS
Summary
Ce travail présente un protocole pour la manipulation de liquides et introduction de l'échantillon à un microcanaux pour in situ à temps de vol des ions secondaires masse analyse par spectrométrie de biomolécules de protéines dans une solution aqueuse.
Abstract
Ce travail démontre la caractérisation in situ de biomolécules de protéines dans la solution aqueuse en utilisant le Système d'analyse à l'interface de vide Liquide (SALVI) et d'ions secondaires spectrométrie de temps de vol de masse (TOF-SIMS). Le film de protéine de fibronectine est immobilisé sur la membrane de nitrure de silicium (SiN) qui forme la zone de détection SALVI. Lors de l'analyse TOF-SIMS, trois modes d'analyse ont été menées, y compris haute spatiale spectrométrie de résolution en masse, en deux dimensions (2D) imagerie, et le profilage en profondeur. Les spectres de masse ont été acquises dans les deux modes positif et négatif. eau désionisée a également été analysée comme échantillon de référence. Nos résultats montrent que le film fibronectine dans l'eau a des pics de cluster de l'eau plus distinctes et plus forte par rapport à l'eau seule. des pics caractéristiques des fragments d'acides aminés sont également observables dans la protéine hydratée spectres ToF-SIMS. Ces résultats montrent que l'adsorption des protéines molécule sur une surface peut être étudiée dynamically utilisant SALVI et ToF-SIMS dans le milieu liquide pour la première fois.
Introduction
L'hydratation est essentielle pour la structure, une conformation, 2 3 et l'activité biologique des protéines. Protéines sans les molécules d'eau qui les entourent ne seraient pas avoir des activités biologiques viables. En particulier, les molécules d'eau interagissent avec la surface et de la structure interne de protéines, et les différents états d'hydratation de protéines font de telles interactions distinctes. 4 L'interaction des protéines avec des surfaces solides est un phénomène fondamental avec des implications dans les nanotechnologies, les biomatériaux et les processus d'ingénierie tissulaire. Des études ont indiqué que les temps des changements conformationnels peuvent se produire en tant que protéine rencontre une surface. ToF-SIMS a été envisagé que la technique qui a le potentiel d'étudier l'interface protéine-solide 7.5. Il est important de comprendre l'hydratation de protéines sur des surfaces solides, qui fournit potentiellement une compréhension fondamentale du mécanisme de leur structure, conformation et biologiqueactivité al.
Cependant, les techniques d'analyse de surface importante sont pour la plupart à base de vide et des applications directes pour les études liquides volatils sont difficiles en raison de l'évaporation rapide de liquide volatil dans l'environnement sous vide. Nous avons développé un vide Interface microfluidique compatible, Système d'analyse à l'interface de vide Liquide (SALVI), pour permettre l'observation directe des surfaces liquides et les interactions liquide-solide en utilisant des ions secondaires spectrométrie de temps de vol de masse (TOF-SIMS). 8- 11 les aspects uniques sont les suivants: 1) la fenêtre de détection est une ouverture de 2-3 um de diamètre et permettant l'imagerie directe de la surface du liquide, 2) la tension de surface est utilisé pour maintenir le liquide dans l'ouverture, et 3) Salvi portable entre plusieurs plates-formes d'analyse. 11,12
SALVI se compose d'un nitrure de silicium (SiN) membrane en tant que zone de détection et un microcanal en polydiméthylsiloxane (PDMS). Il est fabricated dans la salle blanche, et les facteurs de fabrication et de conception clé ont été détaillés dans les documents précédents et les brevets. 8-12 Les applications de TOF-SIMS comme un outil d'analyse ont été démontrées en utilisant une variété de solutions aqueuses et les mélanges de liquides complexes, dont certains qui contenait des nanoparticules. 13-17 précisément, SALVI liquide TOF-SIMS permet dynamique de sondage de l'interface liquide-solide des systèmes vivants biologiques (ie, les biofilms), des cellules individuelles, et l'interface électrolyte solide, ouvrant de nouvelles perspectives pour la phase in situ condensé études, y compris les liquides à l'aide de TOF-SIMS. Cependant, la conception actuelle ne permet pas encore les interactions gaz-liquide. Ceci est une direction pour le développement futur. SALVI a été utilisée pour étudier le film de protéine hydratée dans ce travail pour la première fois.
La fibronectine est une protéine dimère couramment utilisé, constitué de deux monomères à peu près identiques reliées entre elles par une paire de liaisons disulfure, 18 qui is bien connu pour sa capacité à se lier aux cellules. 19,20 Il a été choisi comme système modèle pour illustrer le fait que le film de protéine hydratée pourrait être sondée dynamiquement en utilisant le liquide SALVI TOF-SIMS approche. La solution de protéine a été introduit dans le microcanal. Après une incubation de 12 heures, un film de protéine hydratée formée sur le côté arrière de la membrane SiN. Déminéralisée (DI) a été utilisé pour rincer le canal après l'introduction de protéines. Des informations ont été recueillies auprès de hydratés molécules de protéines de la fibronectine dans le microcanal SALVI utilisant dynamique TOF-SIMS. l'eau DI a également été étudié en tant que témoin de comparer avec les résultats obtenus à partir de couches minces fibronectine hydraté. On a observé des différences marquées entre le film protéique hydratée et de l'eau DI. Ce travail démontre que l'adsorption des protéines sur la surface dans le milieu liquide peut être étudiée en utilisant l'SALVI de roman et de liquide approche TOF-SIMS. Le protocole vidéo est destiné à fournir des conseils techniques pour les gens qui sont intéressésdans l'utilisation de ce nouvel outil d'analyse pour des applications diverses de SALVI avec TOF-SIMS et de réduire les erreurs inutiles dans la manipulation de liquides ainsi que l'acquisition de données TOF-SIMS et l'analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI est une interface qui permet microfluidique surface du liquide dynamique et liquide-solide analyse d'interface par des instruments d'aspiration en fonction, comme TOF-SIMS et microscopie électronique à balayage (MEB). En raison de l'utilisation de petites ouvertures pour exposer liquide directement dans le vide, SALVI est adapté à de nombreuses techniques de spectroscopie et imagerie finement ciblées sans aucune modification; 22 la portabilité et la polyvalence de la microfluidique en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
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