A completa e atualizada "Rotifer policultura Method" para a criação de Primeira Zebrafish Alimentar
Summary
Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This “polyculture” strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an “on-demand”, nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.
Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) é um animal de laboratório pré-eminente utilizada em um número crescente de disciplinas científicas, incluindo, mas não limitado a genética do desenvolvimento, toxicologia, o comportamento, a aquicultura, biologia regenerativa, ea modelagem de muitas doenças humanas 1 – 5. Embora a espécie é relativamente fácil de manter em laboratório, há uma série de desafios de gestão associados à sua cultura 6. A mais proeminente delas é larvicultura, especialmente quando o peixe primeiro começa a alimentar a inflação subseqüente à bexiga de gás 7. Sob condições normais, controlados, este evento desenvolvimento ocorre na ~ 5 dias pós-fertilização (dpf), com os seguintes 3 - 5 dias de crescimento, sendo particularmente crítico 7. A dificuldade técnica central durante este estágio é atender adequadamente as exigências nutricionais do primeiro larvas alimentação – itens de alimentação deve ser de tamanho adequado, Digestible, atraente e disponível em uma base quase contínua, sem a criação de desperdício excessivo em tanques de cultivo. Historicamente, este foi alcançado normalmente através da apresentação de numerosas pequenas quantidades de alimentos para os peixes em tanques, junto com a rotina 8,9 troca de água. Enquanto estes métodos são, até certo grau de sucesso, eles não são eficazes, requerem entradas de trabalho elevadas, e retornar única variável e as taxas de crescimento limitadas e sobrevivência de 10.
Na natureza, larvas do peixe, presumivelmente, se alimentam de zooplâncton abundante pequeno presente na coluna de água 11. Por esta razão, os protocolos que incorporam larvicultura live feeds, tais como Paramecium, rotíferos e Artemia são tipicamente mais eficiente 7. Em 2010, Best e co-autores demonstraram que era possível crescer zebrafish larval em água salobra estática, juntamente com rotíferos de água salgada para os primeiros 5 dias de alimentação exógena 12. Esta abordagem, que aproveitares a alta produtividade natural de culturas de rotíferos para fornecer amplo, presa altamente nutritivos sem poluir a água, produz muito elevadas taxas de crescimento e sobrevivência das larvas com entrada de baixo de trabalho 12,13. Nos últimos anos, um número crescente de laboratórios em todo o mundo adotaram variações deste protocolo, e muitos estão agora a cultura de rotíferos de forma contínua para apoiar os sistemas de viveiro 14.
Ao longo dos últimos anos, os métodos para ambos rotifer / policultura peixe-zebra e produção de rotíferos foram aperfeiçoada e melhorada para se tornar mais padronizado e facilmente escalável. Este artigo fornece instruções passo-a-passo para 1) produção de rotíferos contínuo e robusto e 2) o estabelecimento do sistema / policultura peixe-zebra rotifer usado para apoiar o crescimento robusto de peixe para os primeiros 5 dias de alimentação exógena.
Protocol
Representative Results
Discussion
A implementação bem sucedida do método policultura rotifer para a alimentação de peixes-zebra larval precoce exige protocolos eficazes para duas tarefas: o estabelecimento e manutenção de um sistema de cultura de rotíferos contínua para alimentar os peixes, e cultura de primeira alimentação larvas do peixe junto com rotíferos no mesmo tanque.
A configuração para um sistema de produção de água salgada rotifer contínua para os laboratórios de peixe-zebra primeiro descritos p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O cuidado e uso de peixes gerado por resultados representativos descritos neste protocolo foi realizado em plena conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal Institucional do Hospital Infantil de Boston, protocolo nº 14-05-2673R.
Materials
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 Liter Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
- Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. . The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish, A Practical Approach. , (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
- Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 634-657 (2004).
