"פוליקולטורה שיטת Rotifer" השלמה ומעודכנת לדג הזברה האכלת לתי-פוסקת הראשונה
Summary
Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This “polyculture” strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an “on-demand”, nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.
Introduction
דג הזברה (Danio rerio) היא בחיות מעבדה מראש יחסני מנוצלות במספר הולך וגדל של דיסציפלינות מדעיות, כולל אך לא מוגבל לגנטיקה התפתחותית, טוקסיקולוגיה, התנהגות, חקלאות ימית, ביולוגיה משובי, והמודלים של הפרעות אנושיות רבות 1 – 5. למרות שהמין הוא קל יחסית כדי לשמור על במעבדה, יש מספר אתגרי ניהול המזוהים עם תרבותם 6. הבולט ביותר הוא גידול זחל, במיוחד כאשר הדגים יתחילו ראשון להאכיל לאחר האינפלציה שלפוחית גז 7. בתנאים רגילים, בשליטה, אירוע התפתחותי זה מתרחש ב ~ 5 ימים לאחר הפריה (DPF), עם 3 הבאים – 5 הימים של צמיחה להיות 7 קריטיים במיוחד. הקושי הטכני המרכזי בשלב זה הוא לענות כראוי את הדרישות התזונתיות של זחלי ההאכלה הראשונים – פריטי מזון חייבים להיות בגודל מתאים, digestible, אטרקטיבי, וזמין על בסיס כמעט רציף, ללא יצירת פסולת מוגזמת בטנקי culturing. מבחינה הסטורית זו הושגה בדרך כלל על ידי מתן כמויות קטנות של מזון רבות לדגים בטנקים, יחד עם 8,9 תחלופת מים שיגרתי. בעוד שיטות אלה הן במידה מסוימת מוצלחות, הם לא יעילים, דורשים תשומות עבודה גבוהות, ולחזור רק משתנה ושיעורים מוגבלים של צמיחה והישרדות 10.
בטבע, זחלי דג הזברה ככל הנראה להאכיל בהווה זואופלנקטון קטן בשפע בעמודת המים 11. מסיבה זו, פרוטוקולי larviculture שלשלב הזנות חיות כגון הסנדלית, rotifers, והארטמיה הם בדרך כלל יעילים ביותר 7. בשנת 2010, בסט והמחברים הוכיחו שזה אפשרי לגדל דג הזברה זחל במי סטטי, מליחים יחד עם rotifers המים המלוחים במשך 5 הימים הראשונים של האכלת אקסוגני 12. גישה זו, הרותמת אתes הפרודוקטיביות הגבוהה הטבעית של תרבויות rotifer לספק טרף בשפע, ערך תזונתי גבוהה מבלי לזהם את המים, תשואות שיעורים גבוהים מאוד של צמיחת זחל והישרדות עם תשומת עבודה נמוכה 12,13. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מעבדות ברחבי העולם אימץ וריאציות של פרוטוקול זה, ורבים מהם עכשיו culturing rotifers באופן רציף לתמיכה במערכות משתלת 14.
בשנים האחרונות, שיטות לשני rotifer / פוליקולטורה דג הזברה וייצור rotifer כבר מעודנת והשתפרו להיות יותר סטנדרטי וניתן להרחבה בקלות. מאמר זה מספק הוראות צעד-אחר-צעד ל1) ייצור rotifer רציף וחזק ו 2) הקמת rotifer / מערכת פוליקולטורה דג הזברה משמשת לתמיכה בצמיחה חזקה של דגים במשך 5 הימים הראשונים של האכלת אקסוגני.
Protocol
Representative Results
Discussion
יישום מוצלח של שיטת פוליקולטורה rotifer האכלה דג הזברה זחל מוקדם דורש פרוטוקולים יעילים לשתי משימות: ההקמה ותחזוקה של מערכת תרבות rotifer רציפה כדי להאכיל את הדגים, וculturing הראשון-האכלת זחלי דג הזברה יחד עם rotifers באותו הטנק.
ההתקנה למערכת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הטיפול והשימוש בדגים שנוצרו לתוצאות נציג המתוארות בפרוטוקול זה נערך בהתאם מלא להנחיות שנקבעו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית החולים לילדים בבוסטון, # פרוטוקול 14-05-2673R.
Materials
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 Liter Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
- Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. . The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish, A Practical Approach. , (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
- Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 634-657 (2004).
