CN-GELFrEE - eluida-gel transparente nativo fracción líquida atrapamiento de electroforesis

La mayoría de los procesos biológicos que ocurren dentro de una célula se cree que ser llevado a cabo por los conjuntos de proteínas en lugar de proteínas individuales ^1. En consecuencia, con el fin de elucidar el papel biológico específico de una subunidad de la proteína en una célula que es necesaria para entender sus interacciones estructurales con otras proteínas o ligandos en los complejos ^2. Sin embargo, el estudio de las proteínas de forma nativa, el mantenimiento de sus interacciones y la actividad no covalentes, sigue siendo un reto. Una de las deficiencias de los estudios de proteína nativa es una técnica de separación nativa adecuado que sea compatible con diversas técnicas de análisis de proteínas aguas abajo. Por lo tanto, un interés reciente en las técnicas de separación capaz de caracterizar conjuntos no covalentes de biomoléculas ha aumentado considerablemente ^3.

técnicas de separación de proteínas son imprescindibles para la bioquímica, la biofísica y varios otros estudios. técnicas de separación nativos actuales tienen intrinsic deficiencias que reducen la compatibilidad con los análisis posteriores, como la baja resolución, de bajo rendimiento, pérdida de la precipitación, y la exigencia de grandes cantidades de muestra inicial. Purificación por afinidad en tándem se utiliza comúnmente para estudios de interacción de proteínas, pero tiene que ser llevado a cabo por separado para cada proteína diana, provocando que sea incompatible con el análisis de alto rendimiento ^4. Cromatografía de exclusión de tamaño ^5, precipitación selectiva con cromatografía de afinidad por iones y ⁵ en gradiente de densidad de separación ⁶ todos se han proporcionado separaciones nativas, sino que son inherentemente técnicas de baja resolución y requieren altas cantidades iniciales de la muestra.

Alternativamente, las técnicas a base de gel, como el azul nativo (BN) y Clear Native PAGE (CN) (ya sea 1-D o 2-D), muestran la separación de alta resolución. Por otra parte, en contraste con otras técnicas mencionadas, ambas separaciones PAGE nativos mantienen la solubilidad y la conformación nativa de un amplio range de especies de macromoléculas, incluyendo proteínas hidrófobas. Esta capacidad amplía aún más la cobertura proteoma alcanzado por estos métodos ^7,8 y se logra a través de diferentes química entre CN y BN-PAGE. NC-PAGE se basa comúnmente en detergentes cargados suave como moléculas portadoras, en sustitución del colorante azul de Coomassie en BN-PAGE. BN-PAGE, aunque asociado con una resolución más alta, tiene advertencias, tales como reducción de la actividad enzimática en las proteínas separadas ⁸ y la formación de aductos molécula de Coomassie, siendo este último muy perjudicial para MS aguas abajo análisis ^9. Ambos métodos, sin embargo, están asociados tradicionalmente con baja recuperación y la cobertura proteoma estrecha debido a las manchas y las limitaciones de extracción de gel ^7.

Para el estudio de las proteínas desnaturalizadas, hay varias técnicas que mantienen la solubilidad macromolécula en el desempeño de alta resolución de fraccionamiento con alta recuperación de proteínas y que son compatibles con diVerse técnicas de análisis de proteínas después de la separación. Gel-eluido fracción líquida atrapamiento de electroforesis (GELFrEE) es una de las técnicas de fraccionamiento que se ajustan a todas estas características. Este método se aplica en gran medida en los estudios de alto rendimiento proteómica de arriba hacia abajo, lo que indica que es rápido y versátil. En GELFrEE, las proteínas se desnaturalizan y se separó basan en el peso molecular a través de una matriz de gel tubular, la porosidad de los cuales se puede variar basado en los requisitos de la muestra y los resultados de fraccionamiento deseados. Las fracciones que se eluyen en fase líquida, reduciendo así las limitaciones de recuperación asociados con SDS-PAGE, mientras que se mantiene una alta resolución. Alícuotas de fracciones pueden ser analizados por PAGE 1-D para la selección de ancho de banda de peso molecular ^11. Hay una gran demanda de las ventajas asociadas a GELFrEE en técnicas de separación nativas. El método descrito en este documento, Claro nativo GELFrEE (CN-GELFrEE), es una adaptación natural de GELFrEE. Con el fin de ser compatible con una amplia spectrum de macromoléculas en su estado nativo, este método se basa no sólo en la química CN-PAGE suave, pero también en una separación en gradiente de porosidad, lo que reduce la precipitación de proteínas mediante la eliminación de la dura transición entre porosidades presentes en los sistemas de gel discontinuos ^9. Cuando se aplica a fraccionar complejos de proteínas extraídas de corazón de ratón, fracciones eluidas muestran alta recuperación y una separación de alta resolución de una amplia gama de pesos moleculares se obtuvo. Además, las fracciones resultantes son compatibles con la mayoría de los análisis de proteínas bioquímicas y biofísicas de aguas abajo.