CN-GELFrEE - Clear nativo Gel-eluito Frazione Liquid Entrapment elettroforesi

La maggior parte dei processi biologici che accadono all'interno di una cella si pensa siano svolte da gruppi di proteine ​​piuttosto che singole proteine ^​​1. Di conseguenza, al fine di chiarire il ruolo biologico specifico di una subunità della proteina in una cellula è necessario comprenderne le interazioni strutturali con altre proteine ​​o leganti in complessi ^2. Tuttavia, lo studio delle proteine ​​in modo nativo, mantenendo le loro interazioni e le attività non covalenti, rimane difficile. Uno dei difetti di studi proteina nativa è una tecnica di separazione adeguato nativa che è compatibile con varie tecniche di analisi delle proteine ​​a valle. Pertanto, il recente interesse per le tecniche di separazione in grado di caratterizzare le assemblee non covalenti di biomolecole è aumentato bruscamente ^3.

tecniche di separazione delle proteine ​​sono indispensabili per la biochimica, biofisica e vari altri studi. Attuali tecniche di separazione nativi hanno intrinsic carenze che riducono la compatibilità con le analisi a valle, come la bassa risoluzione, bassa produttività, perdita di precipitazioni, e l'esigenza di grandi quantità di campione iniziale. Tandem purificazione di affinità è comunemente utilizzato per gli studi di interazione proteina, ma deve essere effettuata separatamente per ciascun target di proteine, causando che sia incompatibile con l'analisi high-throughput ^4. Dimensioni cromatografia di esclusione ^5, precipitazione selettiva con lo ione cromatografia di affinità ⁵ e in gradiente di densità separazione ⁶ tutti hanno fornito le separazioni nativi, ma sono intrinsecamente tecniche a bassa risoluzione e richiedono elevate quantità di campione iniziale.

In alternativa, le tecniche di gel a base, come il blu Native (BN) e Clear Native PAGE (CN) (sia 1-D o 2-D), mostrano la separazione ad alta risoluzione. Inoltre, in contrasto con altre tecniche menzionate, sia le separazioni PAGE nativi mantengono solubilità e conformazione nativa di un'ampia range di specie macromolecola, tra cui proteine ​​idrofobiche. Questa funzionalità amplia ulteriormente la copertura proteoma raggiunta da questi metodi ^7,8 e si ottiene attraverso diversi chimica tra CN e BN-PAGE. CN-PAGE si basa comunemente sui detergenti morbido pagano come molecole carrier, sostituendo il colorante Coomassie Blu di BN-PAGE. BN-PAGE, anche se associata a maggiore risoluzione, ha avvertimenti come ridotta attività enzimatica delle proteine ​​separate ⁸ e formazione di addotti Coomassie molecola, quest'ultimo essendo notevolmente pregiudizievoli per MS valle analisi ^9. Entrambi questi metodi, tuttavia, sono tradizionalmente associati a bassa recupero e la copertura proteoma stretta a causa di macchie e le limitazioni di estrazione gel ^7.

Per lo studio di proteine ​​denaturate, ci sono diverse tecniche che mantengono macromolecola solubilità durante l'esecuzione di frazionamento ad alta risoluzione con recupero ad alto contenuto proteico e che sono compatibili con diVerse tecniche di analisi delle proteine ​​post-separazione. Gel-eluite frazione liquida Entrapment elettroforesi (GELFrEE) è una delle tecniche di frazionamento che si adattano tutte queste caratteristiche. Questo metodo è ampiamente applicata in studi high-throughput proteomica top-down, che indica che è veloce e versatile. In GELFrEE, le proteine ​​vengono denaturate e separate in base al peso molecolare attraverso una matrice tubolare di gel, la cui porosità può essere variata in base alle esigenze di esempio ei risultati frazionamento desiderati. Le frazioni eluite sono in fase liquida, riducendo così le limitazioni ripristino associati con SDS-PAGE mantenendo alta risoluzione. Aliquote frazione può poi essere analizzati da 1-D PAGE per peso molecolare selezione della larghezza di banda ^11. C'è forte domanda per i vantaggi connessi con GELFrEE in tecniche di separazione nativi. Il metodo descritto nel presente documento, Cancella Native GELFrEE (CN-GELFrEE), è un adattamento nativo di GELFrEE. Per essere compatibile con un'ampia spectrum di macromolecole nel loro stato nativo, questo metodo si basa non solo sul morbido chimica CN-PAGE, ma anche sulla separazione di porosità pendenza, che riduce la precipitazione delle proteine ​​eliminando la dura transizione tra porosità presenti nei sistemi gel discontinui ^9. Quando viene applicato a frazionare complessi proteici estratti dal cuore del mouse, frazioni eluite visualizzati elevato recupero e la separazione ad alta risoluzione di una vasta gamma di pesi molecolari è stato ottenuto. Inoltre, le frazioni risultanti sono compatibili con la maggior parte analizza valle proteine ​​biochimica e biofisica.