Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Exosomen sind kleine Vesikel mit einer Größe von 30 nm bis 100 nm, das sowohl konstitutiv und nach Stimulation aus einer Vielzahl von Zelltypen freigesetzt werden. Sie sind in einer Reihe von biologischen Flüssigkeiten gefunden und sind dafür bekannt, eine Vielzahl von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuremoleküle tragen. Anfangs angenommen, dass etwas mehr als Reservoire für Zelltrümmer werden die Rollen der Exosomen Regel biologischen Prozessen und bei Erkrankungen mehr geschätzt.
Es wurden mehrere Verfahren zum Isolieren von Exosomen aus Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten beschrieben. Aufgrund ihrer geringen Größe und Dichte, Differenz Ultrazentrifugation und / oder Ultrafiltration sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum exosome Isolation. Ein Plasma aus HIV-1-infizierten Individuen enthalten jedoch beide Exosomen und HIV-Viruspartikel, die eine ähnliche Größe und Dichte. Somit effiziente Trennung der Exosomen aus HIV-Viruspartikeln in menschlichem Plasma wurdeeine Herausforderung.
Um diese Einschränkung zu beheben, eine Prozedur aus Cantin et modifizierten entwickelten wir. al., 2008, für die Reinigung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma. Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten wurden verwendet, um Exosomen aus HIV-1-Partikeln in dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen zu trennen. Viruspartikel wurden durch p24 ELISA identifiziert. Exosomen wurden auf der Basis von Exosom Marker Acetylcholinesterase (AChE) und das CD9, CD63 und CD45-Antigene identifiziert. Unsere Gradienten Verfahren ergab Exosom Präparate frei von Viruspartikeln. Die effiziente Reinigung von Exosomen aus menschlichem Plasma ermöglichte es uns, den Gehalt an Plasma abgeleiteten Exosomen untersucht und ihre immunmodulatorische Potential und andere biologische Funktionen zu untersuchen.
Introduction
Die HIV-1-Epidemie weiterhin einen erheblichen Einfluss in der ganzen Welt haben. Ab 2013 wurden etwa 35 Millionen Menschen weltweit mit HIV leben und 2,1 Millionen von ihnen waren neu infizierten Personen 1. Präventionsstrategien und den Zugang zu antiretroviralen Therapie waren hilfreich bei der Verringerung der Gesamtübernahme von HIV. Allerdings sind einzelne Bevölkerungsgruppen weiterhin auftritt steigt in den Erwerb von HIV 1. Somit gibt es eine fortlaufende Bemühungen, diese Epidemie.
Einer der stärksten Prädiktoren HIV Fortschreiten der Krankheit ist eine chronische Immunaktivierung (CIA) 2-10. Durch anhaltend hohe nachweisbare Zytokine und erhöhte Expression Marker auf der Oberfläche von T-Lymphozyten definiert, CIA, um zurückzuführen: i) kontinuierliche dendritischen Zell Produktion von Typ-I-IFN 11; (ii) direkte Immunaktivierung durch HIV-Proteine Tat, Nef und gp120 12 angetrieben wird; (iii) Translokation von bakteriellen Proteinen in darmassoziierten Immunzellen 6. Der genaue Mechanismus (en) zugrunde liegende chronische, systemische Immunaktivierung bei HIV-Infektion bleibt jedoch vollständig aufgeklärt werden.
Unsere Arbeitsgruppe und andere haben eine Rolle von Exosomen in HIV Pathogenese 15-18 demonstriert. Unsere Arbeitsgruppe hat festgestellt, dass das Nef-Protein wird aus infizierten Zellen in Exosomen 15 ausgeschieden und exosomalen Nef (exNef) im Plasma von HIV-infizierten Personen in Nanogramm Stufen 18 vorhanden ist. Wir haben gezeigt, dass Bystander-CD4 + T-Zellen, um exNef ausgesetzt Folge aktivierungsinduzierten Zelltod abhängig von dem CXCR4-Weg 19, 20 gezeigt ist. Alternativ wurden die Monozyten / Makrophagen refraktär exNef induzierte Apoptose, aber zeigte veränderte zelluläre Funktionen und die Zytokinexpression. Aus dem Plasma von HIV-infizierten Personen isoliert jüngster Zeit hat unsere Gruppe gezeigt Exosomen enthalten eine Vielzahl von pro-inflammatorischen Zytokinen. Fuitere naive periphere mononukleäre Blutzellen von Plasma abgeleiteten Exosomen aus HIV-infizierten Patienten induzierte Expression von CD38 auf naiven und Zentralspeicher CD4 + und CD8 + T-Zellen ausgesetzt werden. Dies trägt wahrscheinlich systemische Entzündungen und Virusvermehrung durch Bystander-Zellaktivierung 21, und schlägt vor, Exosomen spielen eine bedeutende Rolle bei der HIV-Pathogenese.
Bei der Untersuchung der Rolle von Exosomen bei HIV-Pathogenese, ist eine Herausforderung, der Entwicklung von Techniken zur effizienten separaten Exosomen von HIV-Partikel unter Beibehaltung der exosomalen Inhalten sowie deren funktionale immunmodulatorische Fähigkeit. Es wurden mehrere Verfahren zum Isolieren von Exosomen aus Zellkultur und biologischen Flüssigkeiten 22,23 beschrieben. Aufgrund ihrer geringen Größe und Dichte (Exosomen schweben in einer Dichte von 1,15 bis 1,19 g / ml), Differenz Ultrazentrifugation und / oder Ultrafiltration sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum exosome Isolation 23.HIV-infizierten Zellkulturüberständen und Patientenplasma enthalten jedoch beide Exosomen und HIV-1-Viruspartikel. Exosomen und HIV-1-Partikel sind in Größe und Dichte sehr ähnlich. Alternativ, unter Ausnutzung der Expression der eindeutige exosomalen Marker wie CD63, CD45 und CD81, Exosomen isoliert wurden mit Immunaffinitäts-Abscheideverfahren 23. Dieses Verfahren kann Virus von Exosomen trennen. Ist der Nachteil dieser Technik jedoch die dichte Befestigung von Antikörpern gegen die gereinigte Exosomen, die mit der Beurteilung der immunmodulatorischen Potenzial der Exosomen in Kultur stören könnten.
Um diese Einschränkungen zu begegnen, ein Verfahren zur Reinigung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma von Cantin modifiziert und Mitarbeiter 22 unter Verwendung Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten entwickelten wir. Exosomen wurden gefunden, um in der von geringer Dichte zu trennen / oberen Fraktionen von Iodixanol Gradienten, während Viruspartikel im Hoch- getrenntDichte / Unterfraktionen. Viruspartikel wurden durch p24 ELISA identifiziert und wurden unter Verwendung von Exosomen exosome Marker AChE, CD9, CD63 und CD45 identifiziert. Die oberen niedriger Dichte Fraktionen gesammelt enthaltenen Exosomen, die negativ für HIV-1 p24-Kontaminierung waren. Die effiziente Reinigung und Trennung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma ermöglicht eine genaue Prüfung des Inhalts der Exosomen aus Humanplasma, sowie die Untersuchung ihrer immunmodulatorischen Potential und der diagnostischen und prognostischen Wert der Exosomen in HIV-1 Pathogenese abgeleitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chronische Immunaktivierung (CIA) und CD4 + T-Zell-Depletion sind zwei wichtige Merkmale von HIV-1-Infektion. Sie wurden als Prädiktoren für die Pathogenese etabliert, mit der CIA, der beste Prädiktor. Doch die zugrunde liegenden Mechanismen der Fahrt chronische systemische Immunaktivierung und CD4 + T-Zell-Rückgang immer noch nicht vollständig geklärt. Wir und andere Labors haben schlüssige Beweise entwickelt, dass Exosomen von HIV-1 infizierten Zellen sezerniert spielen eine Rolle in beiden Markenzeichen.
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
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