Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

De HIV-1-epidemie blijft een belangrijke invloed in de hele wereld hebben. Met ingang van 2013, ongeveer 35 miljoen mensen wereldwijd werden met hiv, en 2,1 miljoen daarvan waren nieuw geïnfecteerden ^1. Preventiestrategieën en een betere toegang tot antiretrovirale therapie zijn nuttig in het verminderen van de totale overname van HIV geweest. Er zijn echter individuele populatie nog steeds ervaren stijgingen in de overname van ^HIV-1. Aldus is er een behoefte aan verdere inspanningen om deze epidemie.

Eén van de sterkste voorspellers van HIV progressie van de ziekte chronische immuunactivatie (CIA) ^2-10. Bepaald door voortdurend hoge detecteerbare cytokines en verhoogde expressie merkers op het oppervlak van T-lymfocyten, is CIA toegeschreven aan: i) continue dendritische cel productie van type I IFN ^11; (ii) directe immuunactivatie gedreven door HIV eiwitten Tat, Nef en gp120 ^12; (iii) Translocatie van bacteriële eiwitten in darm geassocieerd immuuncellen ^6. De exacte mechanisme (s) onderliggende chronische systemische immuunactivatie in HIV-infectie nog volledig worden opgehelderd.

Onze onderzoeksgroep en anderen hebben een rol van exosomes bij HIV pathogenese ^15-18 aangetoond. Onze fractie heeft vastgesteld dat Nef-eiwit wordt uitgescheiden uit de geïnfecteerde cellen in exosomes ¹⁵ en exosomaal Nef (exNef) aanwezig in het plasma van HIV-geïnfecteerde individuen in nanogram niveau ¹⁸ is. We hebben aangetoond dat omstander CD4 + T-cellen blootgesteld aan exNef resulteerde in activatie geïnduceerde celdood afhankelijk van de CXCR4 traject ^{19, 20.} Alternatief, monocyt / macrofagen waren ongevoelig voor exNef-geïnduceerde apoptose, maar vertoonde veranderde cellulaire functies en cytokine expressie. Onlangs heeft onze groep getoond exosomes geïsoleerd uit plasma van HIV-geïnfecteerde individuen bevatten een verscheidenheid van cytokines. Further, naïeve perifere mononucleaire cellen blootgesteld aan plasma bereide exosomes uit HIV-geïnfecteerde patiënten geïnduceerde expressie van CD38 op naïeve en memory CD4 + centrale en CD8 + T-cellen. Dit zal waarschijnlijk bijdraagt ​​aan systemische ontsteking en virale propagatie via bystander celactivering ^21, en ​​stelt exosomes spelen een belangrijke rol bij HIV-pathogenese.

In het onderzoek naar de rol van exosomes bij HIV pathogenese, is een uitdaging ontwikkelen van technieken om efficiënt scheiden exosomes van HIV-deeltjes terwijl de exosomaal inhoud en hun functionele immune modulerende vermogen. Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor het isoleren van exosomen uit celkweek en biologische vloeistoffen ^22,23. Vanwege hun kleine omvang en lage dichtheid (exosomes drijven met een dichtheid van 1,15 – 1,19 g / ml), differentiële ultracentrifugatie en / of ultrafiltratie zijn de meest gebruikte technieken voor het isoleren exosome ^23.Echter, HIV-geïnfecteerde celkweek supernatanten en plasma van patiënten bevatten zowel exosomes en HIV-1 virale deeltjes. Exosomes en HIV-1 deeltjes zeer vergelijkbaar in grootte en dichtheid. Als alternatief, gebruik te maken van de expressie van unieke exosomaal markers zoals CD63, CD45 en CD81, exosomes zijn geïsoleerd met behulp immunoaffiniteits- capture methoden ^23. Deze procedure kan virus scheiden van exosomes. Echter, het nadeel van deze techniek is de strakke binding van antilichamen tegen het gezuiverde exosomes, die kunnen interfereren met de beoordeling van de immuunmodulerende potentieel van exosomes in kweek.

Om deze beperkingen te pakken we een procedure voor de zuivering van exosomen uit HIV-deeltjes in menselijk plasma modificatie van Cantin en collega's ²² gebruikt iodixanol snelheidsgradiënten ontwikkeld. Exosomes bleken te scheiden in de low-density / bovenste fracties van iodixanol hellingen, terwijl virusdeeltjes gescheiden in de hoog-dichtheid / lagere fracties. Virusdeeltjes werden geïdentificeerd door p24 ELISA en exosomes werden geïdentificeerd met behulp van exosome markers AChE, CD9, CD63 en CD45. De bovenste lage dichtheid fracties verzameld bevatte exosomes die negatief voor HIV-1 p24 besmetting waren. De efficiënte zuivering en scheiding van exosomen uit HIV-deeltjes in menselijk plasma een accurate onderzoek van de inhoud van exosomen uit menselijk plasma en het onderzoeken van hun immuunsysteem modulerende potentiaal en de diagnostische en prognostische waarde van exosomen in HIV-1 pathogenese.