عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Exosomes هي حويصلات صغيرة يتراوح حجمها ما بين 30 نانومتر إلى 100 نانومتر التي تم إصدارها على حد سواء بشكل جوهري وعلى التحفيز من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. وهي توجد في عدد من السوائل البيولوجية ومعروفة لتنفيذ مجموعة متنوعة من البروتينات، والدهون، وجزيئات الحمض النووي. كان يعتقد في البداية أن يكون قليلا أكثر من الخزانات لالحطام الخلوي، وأعرب عن تقديره للأدوار exosomes تنظيم العمليات الحيوية والأمراض على نحو متزايد.
وقد وصفت عدة طرق لعزل exosomes من وسائل الإعلام ثقافة الخلوي والسوائل البيولوجية. ونظرا لصغر حجمها ومنخفض الكثافة، والفرق تنبيذ فائق و / أو الترشيح الفائق هي التقنيات الأكثر شيوعا لexosome العزلة. ومع ذلك، البلازما من HIV-1 الأفراد المصابين يحتوي على كل exosomes والجسيمات الفيروسية فيروس نقص المناعة البشرية، والتي تتشابه في الحجم والكثافة. وهكذا، كان الفصل الفعال للexosomes من فيروس نقص المناعة البشرية الجسيمات الفيروسية في البلازما البشريةتحدي.
لمعالجة هذا القيد، وضعنا إجراء تعديل من Cantin وآخرون. آل.، 2008 لتنقية exosomes من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية في البلازما البشرية. استخدمت Iodixanol تدرجات السرعة للفصل exosomes من HIV-1 الجزيئات في البلازما من HIV-1 الأفراد إيجابي. وقد تم تحديد جزيئات الفيروس عن طريق P24 ELISA. وقد تم تحديد Exosomes على أساس علامات exosome أستيل (أستيلكولينستراز)، والمضادات CD9، CD63، CD45 و. أسفرت إجراءات متدرجة لدينا الاستعدادات exosome خالية من جزيئات الفيروس. تنقية فعالة من exosomes من البلازما البشرية مكنتنا من فحص محتوى exosomes المشتقة من البلازما وللتحقيق إمكاناتهم تغييري المناعة ووظائف بيولوجية أخرى.
Introduction
لا يزال وباء HIV-1 أن يكون لها تأثير كبير في جميع أنحاء العالم. اعتبارا من عام 2013، ما يقرب من 35 مليون شخص في العالم يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية، وكانت 2.1 مليون من هؤلاء الأفراد المصابين حديثا 1. وكانت استراتيجيات الوقاية وزيادة فرص الحصول على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية مفيدة في الحد من الاستحواذ الكلي لفيروس نقص المناعة البشرية. ومع ذلك، السكان الفردية لا تزال تعاني من ارتفاع في اكتساب HIV 1. وبالتالي، هناك ضرورة استمرار الجهود المبذولة لمعالجة هذا الوباء.
واحدة من أقوى تنبئ تطور المرض فيروس نقص المناعة البشرية هو تنشيط جهاز المناعة المزمن (CIA) 10/02. التي تحددها مستويات عالية باستمرار السيتوكينات يمكن اكتشافها وعلامات التعبير مرتفعة على سطح الخلايا الليمفاوية T، وقد نسبت وكالة المخابرات المركزية إلى: ط) المستمر انتاج الخلايا الجذعية من النوع الأول الإنترفيرون 11؛ (ب) تنشيط جهاز المناعة المباشر مدفوعا بروتينات فيروس نقص المناعة البشرية تات، نيف وgp120 12؛ (ج) النبات من البروتينات البكتيرية في الأمعاء المرتبطة الخلايا المناعية 6. ومع ذلك، فإن الآلية الدقيقة (ق) الكامنة المزمنة، تنشيط جهاز المناعة النظامية في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية لا يزال يتعين توضح تماما.
وقد أظهرت مجموعتنا البحثية وغيرها من دور exosomes في التسبب فيروس نقص المناعة البشرية 15-18. وقد قررت مجموعتنا أن البروتين نيف يفرز من الخلايا المصابة في exosomes 15، وexosomal نيف (exNef) موجود في البلازما من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية على المستويين نانوغرام 18. لقد أثبتنا أن المارة أدت CD4 + T-الخلايا المعرضة لexNef في الناجم عن تنشيط الخلايا الموت تعتمد على مسار CXCR4 19، 20. بدلا من ذلك، كانت الوحيدات / الضامة الحرارية إلى موت الخلايا المبرمج exNef التي يسببها، ولكن عرضت الوظائف الخلوية المعدلة وخلوى التعبير. exosomes وفي الآونة الأخيرة، وقد أظهرت مجموعتنا معزولة من بلازما الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية تحتوي على مجموعة متنوعة من السيتوكينات الموالية للالتهابات. فوrther، وخلايا الدم وحيدات النوى المحيطية ساذجة تتعرض لexosomes المشتقة من البلازما من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية الناجمة عن التعبير عن CD38 على خلايا الذاكرة من السذاجة ووسط CD4 + CD8 + T و. هذا من المرجح أن يساهم في الالتهابات الفيروسية ونشر عن طريق تنشيط الخلايا المارة 21، ويشير إلى أن exosomes تلعب دورا هاما في التسبب فيروس نقص المناعة البشرية.
في التحقيق في دور exosomes في التسبب فيروس نقص المناعة البشرية، يتمثل أحد التحديات هو تطوير تقنيات لexosomes منفصلة بكفاءة من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية مع الحفاظ على المحتوى exosomal فضلا عن قدرتها الوظيفية تغييري المناعية. وقد وصفت عدة طرق لعزل exosomes من زراعة الخلايا والسوائل البيولوجية 22،23. بسبب صغر حجمها وانخفاض الكثافة (exosomes تطفو في كثافة 1،15-1،19 ز / مل)، تنبيذ فائق الفرق و / أو الترشيح الفائق هي التقنيات الأكثر شيوعا لexosome العزلة 23.ومع ذلك، بفيروس نقص المناعة البشرية supernatants زراعة الخلايا والبلازما المرضى تحتوي على كل exosomes وHIV-1 الجسيمات الفيروسية. Exosomes وHIV-1 الجسيمات متشابهة جدا من حيث الحجم والكثافة. بدلا من ذلك، والاستفادة من التعبير عن علامات exosomal فريدة من نوعها مثل CD63، CD45، CD81 و، وتم عزل exosomes باستخدام طرق أسر immunoaffinity 23. هذا الإجراء يمكن أن تفصل الفيروس من exosomes. ومع ذلك، فإن عيوب هذه التقنية هو مرفق ضيق من الأجسام المضادة للexosomes النقاء، والتي يمكن أن تتداخل مع تقييم القدرة المناعية للexosomes في الثقافة.
لمعالجة هذه القيود، وضعنا الداخلي لتنقية exosomes من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية في البلازما البشرية المعدلة من Cantin وزملاء العمل 22 باستخدام Iodixanol تدرجات السرعة. تم العثور على Exosomes للفصل في منخفض الكثافة / الكسور العليا من التدرجات iodixanol، في حين أن جزيئات الفيروس قد فصلت في عاليةالكثافة / أقل الكسور. وقد تم تحديد جزيئات الفيروس عن طريق P24 ELISA وتم تحديد exosomes باستخدام علامات exosome اشي CD9، CD63، CD45 و. العلوي الكسور منخفض الكثافة جمعت الواردة exosomes التي كانت سلبية للتلوث HIV-1 P24. تنقية فعالة وفصل exosomes من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية في البلازما البشرية يسمح للفحص دقيق لمحتوى exosomes المشتقة من البلازما البشرية فضلا عن التحقيق في إمكاناتهم تغييري المناعية والقيمة التشخيصية والنذير من exosomes في HIV-1 المرضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنشيط المناعة المزمن (CIA) وCD4 + T استنزاف خلية نوعان من السمات الهامة المميزة للعدوى HIV-1. وقد أنشئت على أنها تنبئ عن المرضية، مع CIA كونه أفضل تنبؤ. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء القيادة تنشيط جهاز المناعة النظامية المزمن وانخفاض خلايا CD4 + T تزال لم توضح تماما. نحن ومخت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). . UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O’Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
