Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

1. Bir Ekstrasellüler Flux yürütülecek olan arabelleğe Güç Ölçme: İki Variations NOT: hesaplamalar ve burada açıklanan yöntemler, bir Ekstraselüler Akı Analyzer kullanılarak geliştirilmiştir. Diğer enstrümanlar için ölçüm hacmi uygun ölçekli olmalıdır. Üretici talimatlarına göre (Materyaller ve Ekipman bakınız) HCl konsantre kullanılarak su içinde 0.1 M standart HCl hazırlayın. Not: Tüm dört enjeksiyon çıkışlarından kullanım için HCI enjeksiyonları hazırlanması için bir örnek hesaplaması, Tablo 1 'de gösterilmiştir: Tablo iyi bir hücre dışı akı tahlil içine 1. Ardışık HCl enjeksiyonu. Ortam içinde HCI standart dilüe carr olan teknik çoğaltır sayısı için Tablo 1 'de olduğu gibi denenmektedir edilmesibir tabak içinde ied, artı bir pipet hatası sağlamak için; örneğin, liman dört teknik çoğaltır A enjeksiyonu için, (48.9 ul x 5) tahlil ortamında (1.1 ul x 5) 0.1 M HCl bir stok hazırlamak. Ölçüm probu kartuşunun her Liman A içine 50 ul dağıtın. Kalan limanlar B, C, ve D için bu yordamı yineleyin Dört liman eklemeler her biri için [2 dakika karıştırın, 1 dakika bekleyin ve 5 dk ölçümü] iki döngü izledi standart kalibrasyon döngüsü ile bir hücre dışı akı tahlil 10, Run (bakınız Şekil 2). Yazılım talimatlarına göre alet yazılımı yukarıda deneyi programlayın. Makinenin içine hazırlanmış kartuşu yükleyin ve yazılım talimatlarına göre kalibrasyonu yapın. Program tarafından istendiğinde, kalibrant içeren plaka kaldırmak ve iyi aracı haline her tahlil ortamı içeren plaka takın; programı devam ettirin. U daha önce gelen kararlı durumda elde edilen 8-10 veri noktaları (genellikle son 8-10 puan) ortalamasını şarkı ve her port ilavesinden sonra, standart asidin her enjeksiyonundan kaynaklanan pH (ΔpH) olarak (kümülatif) farkı hesaplayın. Nmol H karşı ΔpH Plot + ölçüm probu tarafından yakalanan 7 ul hacminde içeriyordu. Doğrusal eğim mph / pmol H + tamponlama gücü (BP) 'dir. Alternatif olarak adımları 1,2-1,3, Tablo 2'de olduğu gibi Liman D'de bir HCI enjeksiyonu takiben bağlantı noktaları A, B, ve C Bir deney için kullanılan bir deneyde, aşağıdaki ΔpH ölçümleri yürütmek dört teknik eşlemeler Hücre dışı akı analiz plakasının (dört arka plan sıcaklık düzeltmesi kuyular hariç) 20 deneysel kuyularda 5 puanlık bir standart eğrinin her noktası oluşturmak için kullanılan. 53464table2.jpg "/> Iyi bir hücre dışı akı tahlil içine Tablo 2. Tek HCl enjeksiyonu. 2. Harici pH Metre Kullanımı arabelleği Güç Ölçme Not: Harici bir pH sondasını kullanarak bir maddenin tamponlama gücünü ölçmek 37 ° C'de sondasını ayarlamak ve deney süresince her reaktifler için bu sıcaklığı korumak için. Üretici talimatlarına göre HCl konsantre kullanılarak su içinde 0.1 M standart HCl hazırlayın. Sıcak pH probu, pH standartları olan tamponlama kapasitesine ölçülecek deney ortamı, ve bir su banyosu içinde 37 ° C'ye kadar 0,1 M HCI. Üretici talimatlarına göre 37 ° C'de pH sondasını kalibre edin. Bir ısı plakası ya da su banyosu kullanılarak analiz boyunca 37 ° C'de tüm reaktifler koruyun. Kısım küçük bir cam bardak veya konik tüp içine tahlil ortamı 10 ml. Sürekli bir dalmış pH prob kullanılarak pH'ı izleyin. Şu şekilde 0,1 M HCI ekleme10-20 ul alikotları orta söylüyorlar. Bir karıştırma çubuğu kullanarak veya elle her asit ilavesinden sonra kabı dönen karıştırma emin olun. PH ölçümü stabilize etmek için bir kaç saniye sonra her eklemeden sonra pH'ı kayıt izin verin. Tablo 3'te görüldüğü gibi, ilave yeterli sayıda doğru eğim hesaplama sağlamak ve deney sırasında beklenen pH aralığını karşılamak için tercih. Tablo 3. pH metre kullanılarak tamponlama gücü ölçümü. Veriler 0.1 M HCl altı 20 ul eklemelerle tipik bir deney temsil etmektedir. Nmol H + karşı komplo ΔpH tamponlama gücü (Şekil 1) temsil eden bir lineer eğim vererek, 7 ul başına katma. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Şekil 1. tamponlama gücü belirlenmesi. HCI standart eğri Tablo 3'te aşağıdaki Tablo 1, Tablo 2 (burada) 'deki gibi ölçülür. Lineer eğri uyum eğimi tamponlama gücü (pH / nmol H + 7 ul içinde) elde edilir. Her nokta n ± SEM = 9 teknik çoğaltır ortalama temsil eder. Tamponlama gücü Yöntem 1 veya yukarıdaki 2 ile bilinen kez iktidarı tamponlama ile ECAR bölerek PPR (pmol H + / dak / mg protein) için ECAR sinyali (mph / dak) dönüştürmek (BP) (mph / pmol H +) ve her bir kuyu protein içeriği ölçekleme: PPR tot (pmol H + / dak / mg protein) = ECAR (mph / dak) / BP (mph / pmol H + 7 ul) iyi (ug) başına / protein Denklem 6 Alternatif olarak, Yöntem aynı deneyleri kullanmaks 1 ya da 2 otomatik veri toplama sırasında PPR hesaplamak için cihaz yazılımı tarafından kullanılan arabelleği Kapasitesi (BC) değerini hesaplamak için. NOT: Cihaz kullanım kılavuzu 12 (sayfa 107) hesaplanması ve M.Ö. olarak açıklanan tamponlama kapasitesi, kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlar BC (mol / L) = mol H + / (ΔpH x tampon hacmi (L)) Denklem 7 Not: Denklem 7'de tanımlanan tamponlama kapasitesi, yukarıda tarif edilen cihaz veya harici pH probu deneylerinde hesaplanabilir. Tamponlama gücü ve tamponlama kapasitesi arasındaki Dönüşüm kolayca (ekli e-tabloyu bakınız) yapılır: BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + 7 ul) / 7 ul) Denklem 8 NOT: tahlili yapmadan önce Eğer biliniyorsa, tamponlama kapasitesi deneysel kurulum sırasında cihaz yazılımı doğrudan girilebilir. Önceki yayın 6'da tarif edildiği gibi, bu yordamı ve çoğu geleneksel tampon sistemlerinde yukarıda kullanılan hesaplamaları uygulanır. NOT: Tablo 4 tamponlama gücü ve çeşitli geleneksel medya tamponlama kapasitesi. Tablo 4. Tamponlama gücü ve seçilen medya tamponlama kapasitesi. 3. C2C12 Miyoblast Hücreleri Kullanarak Hücre dışı Akı Testi Sahne Not: Aşama 3.4.3 içinde, CO 2 açısından farklılık varlığını HCO 3 CO 2 tam dönüşümü için gerekli olmadığını öne C2C12 kültüründe karbonik anhidraz varlığına asit üretimi bağlıdır -türevli vardı – + H +. Ancak, ampirik farklı deneysel sistemlerde bu test om önce öneriliritting karbonik anhidraz. Kültür fare C2C12 11,1 mM glukoz, 2 mM glutamin,% 10 h / h cenin sığır serumu (FBS), 100 U Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) içinde% 95 hava /% 5 CO2 altında 37 ° C'de 13 miyoblastlar / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin. Testten 24 saat önce için 20.000 hücre, aynı kültür ortamında 100 ul plaka / tohum hücre / oyuk, herhangi bir ek kaplama ile 24 oyuklu polistiren hücre dışı akı deney plakası (Malzemeler ve Yöntemler bölümüne bakınız). , FCCP oligomycin seyreltilir ve Krebs Ringer fosfat HEPES (KRPH) deney ortamı (2 mM HEPES, 136 mM NaCI, 2 mM NaH 2 PO 4, 3.7 mM KCI, 1 rotenon artı myxothiazol ve 10x son konsantrasyona HCI (isteğe bağlı) mM MgCI2, 37 ° C'de 1.5 mM CaCl2,% 0.1 w / v yağ asidi-içermeyen sığır serumu albümini, pH 7.4) eklenmiştir. Hücre hazırlığı 30 dakika önce tahlil için, ge aspire yapışık hücreler üç defa yıkamakntly kuyudan orta kaldırmak ve daha sonra yavaş yavaş 500 ul KRPH sözlerine ekledi. Hava altında 37 ° C 'de, üçüncü bir yıkama aşamasından sonra hücreler inkübe (değil% 5, bu bikarbonat içermeyen ortamın pH değerini değiştirdiklerini CO2 altında). Deney başladığında, ek bir alt-tabaka ile, 500 U / ml, karbonik anhidraz ve ya glikoz (10 mM) veya sadece ortam içeren 500 ul taze KRPH kuyularda KRPH değiştirin. Sensör kartuşu yükleme Liman A: 2 ug / ml oligomycin Port B: 0.5 uM FCCP, Port C (analizdeki nihai konsantrasyon da verilebilir) aşağıdaki gibi hücre dışı bir akış algılayıcısı, kartuşun kartuş bağlantı noktalarına Aşama 3.3'te hazırlanan her bir 10x bileşik pipetleyin 50 ul tam bölünen miktarları : 1 uM rotenon, 1 uM myxothiazol, Port D: HCI (yukarıda ve Tablo 2'de tarif edildiği gibi bir in-deney asit kalibrasyon gerçekleştirmek ise). NOT: Tüm solunum zincir engellenmesi amacı Burada anlatılan için, 1 uM benimxothiazol 1 uM antimycin A ile değiştirilerek kullanılabilir Ekstrasellüler akış deneyi: 10 de tarif edildiği gibi, solunum kontrol belirlenmesi için standart bir hücre dışı akı tahlili gerçekleştirin. NOT: Deneyin her segment için, karışımı belirlemek bekleyin ve ölçüm süreleri kesimi başına döngü yanı sıra numarası, istenilen. NOT: Tablo 5'teki veriler üç deney çevrimleri tamponlama kalibrasyonu için HCI (farklı miktarlarda Port D ilave edildikten sonra meydana gelen, 2 dk karışımı, 1 dakika bekleyin ve her segment için 5 dakika ölçüm iki deney çevrimi üzerinde toplandı Tablo 2 deki gibi gücü). Tablo 5. Hücre dışı akı tahlil yapılandırması. 4. Measuring sonu nokta Laktat Konsantrasyon Not: azaltılması (2 dakika boyunca), ilk hızının ölçümü geleneksel bir 96 oyuklu plaka içerisinde direkt olarak belirlenebilir hücre dışı bir akı deneyin sonunda bazı farklı sistem, son nokta laktat konsantrasyonu burada tarif Dolaylı tahlil doğrulamak için NAD + → NADH, bizim daha önceki yayında 6 ayrıntılı olarak tarif laktat dehidrojenaz ile katalize. Örnek Sonuçlar sunulan veriler için, glükoz-ihtiva eden test gözlerine bitiş noktası laktat konsantrasyonu ~ 40 uM idi. 2x hidrazin orta hazırlayın: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM hidrazin, pH 9.8 22 ° C'de),. Hemen deney başlamadan önce, 40 U / ml 4 mM ve laktat dehidrojenaz (LDH) NAD + ilave edin. Nihai deney ortamı bileşimi (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM, hidrazin, 2 mM NAD +, 20 U / ml LDH. Hemen hücre dışı akı tahlili sonra, 100 kaldırmaOpak bir (siyah) bir çukuruna hücre dışı akı deney plakası ve iletiminin her kuyudan tahlil ortamı 96-çukurlu plaka ul. Her bir numune için, 100 ul 2x hidrazin orta ekleyin. Hemen bir mikro-okuyucu plaka yük ve 340 nm uyarma / 460 nm emisyon NADH floresan izleme başlar. Yaklaşık 2 dakika boyunca başlangıç ​​hızı kaydedilir. 0 ila 50 uM ilave laktat konsantrasyonları için laktat konsantrasyonuna karşı başlangıç ​​hızını gösteren standart bir eğri oluşturmak için benzer bir deney başlat. Her deneysel iyi standart eğri kullanılarak laktat konsantrasyonunu hesaplayınız. 5. Protein İçeriği Ölçme Deney plakasının her bir oyuğuna kalan deney ortamını çıkarın. Alt kuyu yüzeyindeki hücrelerin yerini değiştirmemek en aza indirmek için dikkatli olmak, BSA içermeyen KRPH ul wells 250 ile üç kez yıkayın. 25 ul RIPA lizis ekleortamı (150 mM NaCI, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA,% 1 h / h Triton X-100,% 0.5 w / v sodyum deoksikolat,% 0.1 h / h SDS, 22 ° C'de pH 7.4) deney plakasının her oyuğuna. 30 dakika boyunca buz üzerinde plaka inkübe edin. 5 dakika boyunca 1200 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde çalkalayın plaka. Liziz tamponu bileşimin ölçümü yöntemi ile uyumlu hale getirmek için, bir BCA aracıyla, örneğin, standart yöntemler, protein konsantrasyonu ölçümü. Şekil 2'de deneyde protein içeriği ~ 4 ug / oyuk oldu.