מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג
Summary
Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.
Abstract
Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate– + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3– + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.
Introduction
המטרה הכוללת של שיטה זו היא למדוד את קצב glycolytic של תאים באמצעות ניתוח שטף תאי מדויק. מדידת כמותית של שיעור glycolytic באמצעות החמצה תאית היא נקודת הסיום הרצויה של ניסויים רבים. עם זאת, השיעור הכולל של החמצה תאית הוא הסכום של שני מרכיבים: החמצת נשימה, בצורה של CO 2 (שמוסיף נוזלים לH 2 CO 3 אז dissociates לHCO 3 – + H +), והחמצת glycolytic, בצורה של חומצת חלב – + + H.
התרומות של CO 2 להחמצה תאית כוללת שעד לאחרונה נחשבו זניחות בפלטפורמת המדידה המשמשת כאן, מנתח XF24 7. עם זאת, ברור במספר רב של מערכות אחרות שCO 2 יכולים להיות תורם עיקרי להחמצת 4-5 תאיים. ניירות מרובים להכיר קון זהtribution, אבל אל תנסה לכמת ישיר של CO 2 -derived 3,8,9 חומצה. לאחרונה הפגינו כמותית שCO 2 ייצור הוא מקור משמעותי של החמצה תאית במערכת זו 6. יתר על כן, למרות שיש מספר רב של מסלולי מטבוליים שיוצרים CO 2 מפירוק גלוקוז, המתבצע על ידי dehydrogenases מטריצה במעגל החומצה הציטרית הם התורמים המכריע וכל המקורות האחרים לייצר כמויות של CO 2 הנמצאות בניסוי השגיאה 6.
ללא תיקון לCO 2 ייצור, החמצה תאית לכן מחוון משמעי של שיעור glycolytic ולא ניתן להשתמש בו כמותית. הפרסום הקודם שלנו מדגיש כמה מקרים שבם הנשימה CO 2 כוללים את חלק הארי של כוללת אות החמצה, גם בתאים האמינו בדרך כלל להשתמש גליקוליזה 6 בעיקר. בנוסף,CO 2 תרומת נשימה להחמצה כוללת משתנית מאוד במהלך ניסויי פרופיל מטבולים משותפים, הוכחה כי השוואה נכונה של שיעור glycolytic במהלך חלקים שונים של ניסוי דורשת תיקון לCO 2.
כדי למדוד את קצב glycolytic של תאים תוך שימוש בשיעור של החמצה תאית, יש צורך להמיר שינויי pH לשינויים בסך הכל + H שנוצרו, וכדי להפחית את החמצה תאית הנגרמת על ידי CO 2 שפורסמה במהלך פעולה של מעגל החומצה הציטרית. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה למדידת קצב ייצור פרוטון תאי (משינויים תאיים בpH והכוח המכויל החציצה של מדיום assay) ו- CO 2 ייצור (משינויים תאיים בO 2 ריכוז), ולהדגים כיצד לחשב את שיעור glycolytic באמצעות מדידות אלה.
כוח בשיטה זו ens השירות של מדידת החמצה תאית על ידי השימוש בו כדי לחשב כראוי שיעור glycolytic כפי שהוגדר בייצור חומצת החלב. ללא תיקון לCO 2 הנשימה (או מדידה ישירה של חומצת החלב), שאי אפשר לקבוע אם ובאיזו מידה הכוללת שיעור החמצה משקף שיעור glycolytic, בלבול הפרשנות של ניסויים המשתמשים בהחמצה תאית כוללת, כפי שמדידה ישירה של ייצור חומצת החלב.
חישובים
CO 2 וחומצת חלב הם, בתוך שגיאה ניסיונית, שני התורמים רק לייצור חומצה תאי, המבוססים על ניסויים עם תאים והיצמדות למנגנון 6. לכן, שיעור החמצה מוחלטת תאית (PPR, קצב ייצור פרוטון) יכול להיות מוגדר כ:
טוט PPR משוואת glyc = PPR שו"ת + PPR 1
. _content "> בי טוט = כולל; שו"ת = נשימה; = PPR glycolytic glyc glycolytic היא כך:glyc PPR = PPR טוט – PPR שו"ת משוואה 2
כאן,
טוט טוט = ECAR PPR / BP משוואה 3
שם ECAR = שיעור תאי החמצה (MPH / min), וBP = כוח באגירה (MPH / H pmol + 7 μl), ואילו
PPR שו"ת = (10 1 / (1 + 10 pH-PK 1) pH-PK) (H מקסימום + / O 2) (OCR טוט – OCR ריקבון / MYX) משוואה 4
כאשר K 1 = קבוע שיווי משקל משולב של CO 2 לחות וניתוק לHCO 3 – + H +; המקסימום H + / O 2 = ההדואר CO 2 החמצת -derived לשינוי מטבולים מסוים כגון חמצון של גלוקוז 6 מלא; = שיעור OCR חמצן הצריכה (O pmol 2 / min), וריקבון OCR / MYX = OCR לא המיטוכונדריה.
משוואה 4 מבודדת OCR המיטוכונדריה על ידי הפחתת כל OCR לא המיטוכונדריה (מוגדר כOCR כי הוא עמיד לrotenone המיטוכונדריה הנשימה הרעלים וmyxothiazol) ומהווה H המרבי + שנוצר לO 2 נצרך לכל מצע (H מקסימום + / O 2 ) (ראה 6), כמו גם את חלקם של CO 2 והוליד + H בטמפרטורה הניסיונית וpH (1 / (1 + 10-PK pH pH 10-PK 1). לחמצון מלא של גלוקוז, חמצן המיטוכונדריה שיעור הצריכה (OCR) הוא בדיוק שווה לשיעור של CO 2 ייצור. במרותק נפח assay של מדידת שטף תאית, CO 2 תוצרתד על ידי נשימה נשאר לכודים במדיום assay. רוב CO 2 לכודים הוא התייבשות לH 2 CO 3, אשר לאחר מכן dissociates לHCO 3 – + H +. חלק קטן נשאר מומס אבל לא התייבשות, ועוד חלק קטן הוא התייבשות אבל לא ניתק, כפי שהוכתב על ידי thermodynamically קבוע שיווי משקל בשילוב של CO 2 לחות וניתוק לHCO 3 – + H + בטמפרטורת ניסוי (37 ° C) ו- pH (~ 7.4).
לפיכך, המשוואה המלאה לחישוב g PPR על ידי הפחתת שו"ת PPR מטוט PPR הוא:
טוט PPR glyc = ECAR / BP – (PK-pH 1 / (1 + 10 pH-PK 1) 10) (H מקסימום + / O 2) (OCR טוט – OCR ריקבון / MYX) משוואה 5
אניn בדרך זו, שיעורי נשימה וגליקוליזה, כמו גם שיעורי ייצור ATP הקשורים, ניתן לקבוע כמותית ממדידות פשוטות (צריכת חמצן, החמצה תאית, קיבולת חציצה) ויבוא או חישוב ערכים הנדרשים אחרים (H + / O 2 , P / O, ושיווי המשקל K הקבוע 1) 6. הניסוי המתואר כאן מרחיב על טכניקות סטנדרטי לשימוש תאי שטף Analyzer כגון סוסון הים XF24 10,11; לפורמטים אחרים מדידת שטף תאית (למשל, דואר XF 96, או XFP), כל הכרכים שלהלן יש לשנותם כראוי.
הכח באגירה של מדיום assay ניתן למדוד על ידי הבנייה של עקומה סטנדרטית במישרין בפלטפורמת השטף תאית או בנפרד באמצעות בדיקה pH מכוילת. הנה, שלוש אפשרויות למדידת חציצה על ידי מדיום assay שטף תאי מקבלות, כולל שימוש בכל להזריקביציאות של מנתח השטף תאי עם בארות תא ללא מדגם, או באמצעות יציאת הזריקה האחרונה רק בבארות המכילות תא (סעיף 1) או באמצעות מדידה חיצונית pH (סעיף 2). ראה הגיליון האלקטרוני המצורף לחישובי הנתונים מלאים של דוגמא.
כדי למדוד את כוח החציצה באמצעות יכולת זיהוי-pH של מכשיר השטף תאי, זה בטוח להשתמש בארות תא ללא למזער וריאציה אות. עם זאת, בתוך השגיאה, אין הבדל סטטיסטי קיים בין ובארות בעת ביצוע מדידה זו המכילה תא-תא ללא (מידע לא מוצג). הערה: הווריאציה המתוארת בשלב 1.7 נושאת את היתרון של טיפול חשבונאי בשינויי פוטנציאל אגירה שמעניק תרכובות נוספות או על ידי הנוכחות של תאים, עם החסרון של אות רועשת. עם זאת, כאמור לעיל, לא נמצאו הבדלים משמעותיים בכח באגירה מחושב בין עיצוב התא ללא מוצג בטבלה 1 והעיצוב שלאחר הניסוי בטבלה 2 תחת תנאי הניסוי המתוארים כאן.
בנוסף, על טווחים קטנים ΔpH (<0.4 יחידות; בניסוי הטוב ביותר המוגבלים ל -0.2 יחידות), המדרון ליניארי שהתקבל על ידי התוויית קמ"ש / H pmol Δ + כראוי קרוב היחסים בין לוגריתמי ΔpH ו[ + H]. השיפוע של עקומת סטנדרט זה ולכן מייצג את הכח באגירה של מדיום assay הנבדק ב+ H pH / nmol ב -7 μl, או + H קמ"ש / pmol ב -7 μl. אנו ממליצים להגדיל את כוח חציצה בינוני או הפחתת צפיפות תא לדגימות שתעלינה על שינוי יחידת 0.2 pH בזמן המדידה. זמן המדידה גם עשוי להיות ירידה, אבל זה עשוי לקצר את שיעור החמצת מצב היציב ולהציג את השגיאה בחישוב השיעור.
Protocol
Representative Results
Discussion
החמצה תאית היא אינדיקציה נמדדת בקלות של קצב חילוף חומרים תאי. כדי לקבוע כראוי השיעור של גליקוליזה הסלולרית (כהגדרתו על ידי ייצור חומצת החלב) זה קריטי לדעת את הכח באגירה של מדיום assay, ולהמיר את מדידות שטף תאית של צריכת חמצן והחמצה לפרוטון שיעורי ייצור. על ידי ביצוע חישוב זה, יכול להיות מופחת החמצה נובעת מCO 2 שוחרר במעגל החומצה הציטרית, עוזבת את החמצה שנובעת מייצור חומצת החלב.
הדרכים שונות מרובות הניתנות כאן כדי למדוד כוח באגירה לתיקון זה לשאת יתרונות וחסרונות שונים. מדידה חיצונית באמצעות בדיקה pH היא מדויקת מאוד לשחזור, אבל עלול שלא לשקף הבדלים קטנים בזיהוי pH הוצג על ידי fluorophores בתוך צלחת assay, התוספת של תרכובות בassay, או הנוכחות של tהוא התאים עצמם. מדידות pH לטפל בצלחת נושאים אלה, אלא גם להציג את הדרגות שונות של רעש ניסיוני.
CO 2 התיקון לECAR מאפשר בפעם הראשונה החישוב חד-משמעי וכמותי של שיעור glycolytic, ומגלה וריאציה בתרומת נשימה וglycolytic לECAR הכולל במהלך ניסוי. שימוש במשוואה 5 והמדידות של OCR, ECAR, וחציצת כוח, שיעור glycolytic יכול להיות מחושב באמצעות הגיליון האלקטרוני פשוט סיפק (לוח 6). שיעור זה יכול להיות מאומת על ידי מדידת חומצת החלב פוסט הוק-אם תרצה 6. בתאים שבו מסלול פנטוז פוספט הוא פעיל מאוד, השימוש במעכבי מסלול כגון 6-aminonicotinamide עשויים להיות שימושיים לבודד את שיעור glycolytic. חישוב התרומות של שני CO 2 – ו+ H-נגזר חומצת החלב מהסך נמדדו סלולרי במיוחד החמצת דרג וחמצן Consumptיון דרג הוא כלי רב ערך עבור שימוש בנתוני שטף תאיים להצהיר הצהרות חזקות וכמותי על פעילות המטבולית.
שימוש בהליכים שתוארו כאן, כולל שינויים שונים למדידת כוח באגירה, ואופטימיזציה של ניסוי השטף תאי לתאים תחת חקירה והנתונים הרצויים, השיעור של גליקוליזה בתאים שלמים ניתן לכמת במגוון רחב של תנאי ניסוי. שיטה זו מוגבלת לתאים שיכולים לגדול בתרבות חסיד ב( או תאים או אברונים שניתן דבקו) משטח קלקר. זה אמין ביותר כאשר תאים בתרבית הם הומוגנית ומחוברות, אם כי ייתכן שעדיין ניתן לקבל מידע שימושי על פני טווח של תנאים אלה. החישובים דורשים ידע מסוים בחילוף החומרים של התאים, כמו מקס H + / O 2 טווחים 0.65-1.0 לחמצון מלא של מצעים שונים ויותר לחמצון חלקי 6, לעומת זאת, אם התאים הם known לחמצן גלוקוז, ערך של 1.0 ניתן להניח.
למרות שרלוונטי לכל האפיון מטבולים, שיטה זו עשויה להיות מועילה במיוחד בעת שימוש במערכות שבמשמרת בין חילוף חומרים בדרכי הנשימה וglycolytic כדי לשמור על אספקת ATP הסלולרית היא פנוטיפ קריטי, כולל האפיון של תאי גזע ותאים סרטניים שמקורם בגידול. הבנת שינויי שליטת חילוף חומרים בהקשרים אלה ואחרים תאפשר מידה רבה יותר של תחכום ודיוק בעיצוב והניתוח הניסיוני של סוגי התאים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).
Materials
| Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
| Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
| Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
| XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
| HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
| oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
| FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
| Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
| Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
| FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
| penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
| carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
| 96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
| NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
| LDH | Sigma | L1254 | chemical |
References
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).
- Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).
- Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism. Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).
- Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), e21746 (2011).
- Seahorse Biosciences. . F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).
- Blau, H., Chiu, C., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons. Cell. 32, 1171-1180 (1983).
