Mesure et analyse de la production extracellulaire acide pour Déterminer glycolytique Taux

1. Mesurer Buffering Puissance en un flux Instrument extracellulaire: deux variantes REMARQUE: les calculs et les méthodes décrites ici ont été développées à l'aide d'un analyseur de Flux extracellulaire. Pour les autres instruments, le volume de mesure doit être mise à l'échelle appropriée. Préparer 0,1 M HCl norme dans l'eau en utilisant du HCl concentré (voir matériel et équipement) selon les instructions du fabricant. Remarque: Un exemple de calcul pour préparer des injections HCl pour une utilisation dans les quatre ports d'injection est indiqué dans le Tableau 1: Tableau 1. injections consécutives HCl dans un dosage flux extracellulaire ainsi. Préparer des dilutions de la norme HCl dans le milieu à doser comme dans le tableau 1 pour le nombre de répétitions techniques étant carrIED dans une plaque, plus un pour permettre à l'erreur de pipetage; par exemple, pour les quatre répétitions techniques du port A d'injection, préparer un stock de (1,1 pi x 5) HCl 0,1 M dans (48,9 pi x 5) milieu de dosage. Distribuer 50 ul dans chaque port A de la cartouche de la sonde de mesure. Répétez cette procédure pour les ports restants B, C, et D. Exécutez un test de flux extracellulaire 10 avec un cycle d'étalonnage standard, suivie de deux cycles de [2 min mélange, 1 min d'attente, et 5 min de la mesure] pour chacun des quatre ajouts portuaires (voir la figure 2). Programmer l'expérience ci-dessus dans le logiciel de l'instrument selon les instructions du logiciel. Charger la cartouche préparé dans la machine et effectuer le calibrage selon les instructions du logiciel. Lorsque vous êtes invité par le programme, retirez la plaque contenant étalon-et insérer la plaque contenant du milieu d'essai dans chaque puits dans l'instrument; poursuivre le programme. U chanter la moyenne de 8-10 points de données obtenues à l'état d'équilibre (en général les 8-10 derniers points) avant et après chaque addition de port, calculer la (cumulatif) différence de pH (ApH) causés par chaque injection d'acide standard. Tracer ApH contre nmol H + contenu dans le volume 7 ul piégé par la sonde de mesure. La pente linéaire est le pouvoir tampon (BP) en MPH / pmol H +. Alternativement aux étapes 1,2-1,3, effectuer les mesures suivantes de ApH un essai dans lequel des ports A, B, et C sont utilisés pour mener une expérience, suivie par une injection HCl à Port D. Comme dans le tableau 2, quatre répétitions techniques sont utilisé pour générer chaque point d'une courbe standard de 5 points dans les 20 puits expérimentaux (à l'exclusion des puits de correction de température de quatre de fond) de la plaque de flux extracellulaire de dosage. 53464table2.jpg "/> Tableau 2. injection HCl simple dans un test de flux extracellulaire bien. 2. Mesurer Buffering alimentation Utilisation d'un pH-mètre externe NOTE: Pour mesurer le pouvoir tampon d'un support en utilisant une sonde de pH externe, étalonner la sonde à 37 ° C et maintenir cette température pendant tous les réactifs pendant l'expérience. Préparer 0,1 M HCl norme dans l'eau en utilisant du HCl concentré selon les instructions du fabricant. Chaud sonde de pH, les normes de pH, le milieu de dosage dont le pouvoir tampon est à mesurer, et du HCl 0,1 M à 37 ° C dans un bain d'eau. Calibrer sonde de pH à 37 ° C selon les instructions du fabricant. Maintenir tous les réactifs à 37 ° C tout au long de l'essai en utilisant une plaque chauffante ou un bain d'eau. Aliquote de 10 ml du milieu d'essai dans un petit bêcher ou un tube conique. Contrôler le pH en continu en utilisant une sonde de pH immergé. Ajouter HCl 0,1 M comme à ladire en 10-20 aliquotes pi de milieu. Assurer le mélange à l'aide d'une barre d'agitation ou par tourbillon manuellement le conteneur après chaque addition d'acide. Attendre quelques secondes pour la mesure du pH pour stabiliser, puis enregistrer le pH après chaque addition. Comme le montre le tableau 3, faire un nombre suffisant d'ajouts pour assurer calcul de pente précis et pour couvrir la gamme de pH attendu pendant l'expérience. Tableau 3. Mesure de la puissance de mise en mémoire tampon en utilisant un pH-mètre. Les données représentent une expérience typique avec six additions de 20 ul de HCl 0,1 M. Plot ApH contre nmol ajouté par H + 7 ul, ce qui donne une pente linéaire qui représente le pouvoir tampon (Figure 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.dans les pages = "always"> Figure 1. Déterminer pouvoir tampon. HCl courbe d'étalonnage mesurée comme dans le tableau 1, le tableau 2 ou (ici) comme dans le tableau 3. La pente de la courbe en forme linéaire donne le pouvoir tampon (pH / nmol H + dans 7 ul). Chaque point représente moyenne ± SEM de n = 9 répétitions techniques. Une fois que le pouvoir tampon est connu par la méthode 1 ou 2 ci-dessus, convertir le signal de ECAR (mph / min) à PPR (pmol H + / min / protéine ug) en divisant ECAR par la puissance mise en mémoire tampon (BP) (MPH / pmol H +) mise à l'échelle et à la teneur en protéine de chaque puits: PPR tot (pmol H + / min / pg de protéine) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H + à 7 pi) / protéines par puits (pg) L'équation 6 Sinon, utilisez les mêmes expériences dans la méthodes 1 ou 2 pour calculer la capacité tampon (BC) valeur utilisée par le logiciel de l'appareil pour calculer automatiquement PPR lors de la collecte de données. REMARQUE: L'utilisateur de l'instrument manuel 12 (page 107) fournit des informations détaillées sur le calcul et l'utilisation de la capacité tampon, où BC est décrit comme BC (mol / L) = moles H + / (ApH x volume tampon (L)) L'équation 7 NOTE: Le pouvoir tampon tel que défini dans l'équation 7 peut être calculée dans les essais de l'instrument ou de la sonde de pH externe décrites ci-dessus. Conversion entre pouvoir tampon capacité tampon et se fait facilement (voir tableau joint): BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + à 7 pi) / 7 pi) de l'équation 8 NOTE: Si connue avant d'effectuer le test, la capacité tampon peut être entré directement dans le logiciel de l'appareil lors de l'installation expérimentale. Appliquer cette procédure et les calculs utilisés ci-dessus pour la plupart des systèmes tampons classiques, comme décrit dans la publication précédente 6. NOTE: Le tableau 4 donne la liste de pouvoir tampon capacité tampon et de plusieurs médias conventionnels. Tableau 4. pouvoir tampon et la capacité de mise en mémoire tampon des médias sélectionnés. 3. Réalisation d'une extracellulaire Flux dosage utilisant cellules C2C12 de myoblastes NOTE: Dans l'étape 3.4.3, il n'y avait pas de différences observées dans CO 2 -derived production d'acide dépend de la présence de l'anhydrase carbonique dans la culture C2C12, suggérant que sa présence ne soit pas nécessaire pour la conversion complète de CO 2 à HCO 3 – H + +. Cependant, tester empiriquement ce dans différents systèmes expérimentaux est recommandé avant omanhydrase carbonique itting. Culture souris C2C12 de myoblastes 13 à 37 ° C sous 95% d'air / 5% de CO2 dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec du glucose 11,1 mM, 2 mM de glutamine, 10% en volume de sérum / v bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. 24 h avant l'essai, les cellules plaque / graines dans 100 ul du même milieu de culture à 20.000 cellules / puits dans une plaque de dosage à 24 puits en polystyrène flux extracellulaire (voir Matériels et Méthodes) sans revêtement supplémentaire. Diluer oligomycine, FCCP, et la roténone, plus myxothiazol et HCl (en option) à 10x concentration finale dans Krebs Ringer phosphate HEPES (KRPH) milieu de dosage (2 mM HEPES, NaCl 136, 2 mM NaH 2 PO 4 mM, KCl 3,7, 1 mM de MgCl2, 1,5 mM de CaCl2, 0,1% p / v d'albumine de sérum bovin gras-acide, pH 7,4 à 37 ° C). La préparation des cellules 30 min avant le test, laver les cellules adhérentes trois fois en aspirant à GEretirer ntly le moyen du puits, puis en ajoutant lentement 500 KRPH ul. Incuber les cellules après l'étape de lavage troisième à 37 ° C sous air (pas moins de 5% de CO 2, ce qui modifiera le pH de ce milieu exempt de bicarbonate). Au début de l'essai, remplacer KRPH dans les puits avec 500 pi KRPH frais contenant anhydrase carbonique 500 U / ml et soit du glucose (10 mM) ou seulement moyen, sans substrat supplémentaire. Chargement de la cartouche du capteur Pipet 50 aliquotes de chaque composé 10x préparé à l'étape 3.3 dans les ports d'une cartouche extracellulaire flux de capteur comme suit (concentrations finales dans les tests ainsi donnés) de la cartouche: Port A: 2 pg / ml oligomycine, Port B: 0,5 uM FCCP, Port C : roténone 1 uM, 1 uM myxothiazol, Port D: HCl (si l'exécution d'une calibration in-dosage de l'acide comme décrit ci- dessus et dans le tableau 2). NOTE: dans le but d'une inhibition complète de la chaîne respiratoire décrit ici, 1 pm mesxothiazol peut être utilisé de manière interchangeable avec 1 uM antimycine A. Extracellulaire dosage flux: Effectuez un test de flux extracellulaire standard pour la détermination du contrôle respiratoire comme décrit dans 10. NOTE: Pour chaque segment de l'expérience, de déterminer la combinaison, attendez, et les temps de mesure souhaitée, ainsi que le nombre de cycles par segment. REMARQUE: Les données du tableau 5 ont été recueillies au cours de deux cycles de dosage de 2 min mix, 1 minutes d'attente, et à 5 min mesure pour chaque segment, avec trois cycles d'essai se produisant après l'addition du port D de différentes quantités de HCl (pour l'étalonnage de la mémoire tampon puissance comme dans le Tableau 2). Tableau 5. configuration de test flux extracellulaire. 4. DE MESUREFin ng-point de la concentration de lactate Remarque: Afin de valider le test indirect décrit ici dans un système différent, le point extrémité concentration de lactate à la fin d'une expérience de flux extracellulaire peut être déterminée directement dans une plaque à 96 puits classique par mesure de la vitesse initiale (plus de 2 minutes) de réduction de NAD + NADH → catalysée par la lactate déshydrogénase, décrit en détail dans notre publication préalable 6. Pour les données présentées dans Les résultats représentatifs, la concentration de lactate de point final dans les puits d'essai contenant du glucose était ~ 40 pm. Préparer moyen d'hydrazine 2x: 1 M de Tris, 20 mM d'EDTA, 400 mM d'hydrazine à pH 9,8 à 22 ° C). Immédiatement avant le début de l'essai, ajouter NAD + 4 mM de lactate déshydrogénase et (LDH) à 40 U / ml. Composition de milieu d'essai final (1x): 500 mM de Tris, 10 mM d'EDTA, 200 mM d'hydrazine, 2 mM de NAD +, 20 U / ml de LDH. Immédiatement après le dosage flux extracellulaire, retirer 100pi de milieu de dosage de chaque puits de la plaque de dosage flux extracellulaire et le transfert à un puits d'une opaque (noir) plaque de 96 puits. Pour chaque échantillon, ajouter 100 pi 2x moyen d'hydrazine. Charger immédiatement la plaque dans un lecteur de microplaques et de commencer à surveiller la fluorescence de NADH à 340 nm d'excitation / émission à 460 nm. Enregistrer la vitesse initiale d'environ 2 min. Exécuter une expérience similaire à construire une courbe d'étalonnage en traçant la vitesse initiale de la concentration de lactate pour des concentrations de lactate ajoutés de 0 à 50 uM. Calculer la concentration de lactate dans chaque puits expérimental utilisant la courbe standard. 5. Mesure Teneur en protéines Retirer le reste de milieu d'essai à partir de chaque puits de la plaque de dosage. Laver les puits trois fois avec 250 ul KRPH libre-BSA, en prenant soin de minimiser le délogement des cellules de la surface de fond de puits. Ajouter 25 ul lyse RIPAmoyen (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, 1% v / v de Triton X-100, 0,5% p / v de désoxycholate de sodium, 0,1% v / v de SDS, pH 7,4 à 22 ° C) à chaque puits de la plaque de dosage. Incuber la plaque sur de la glace pendant 30 min. Agiter la plaque sur un agitateur de plaque à 1200 rpm pendant 5 min. Mesurer la concentration de protéines par des procédés classiques, par exemple par dosage BCA, en veillant à ce que la composition du tampon de lyse est compatible avec la méthode de mesure. La teneur en protéines dans l'expérience sur la figure 2 était d'environ 4 ug / puits.