Endotoksin ve DNA İçeriği için Hava örneklenmiş Filtresi Analizi
Summary
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
Açık aerosol araştırmaları yaygın filtreler örneklenmiş partiküler madde kullanır. Bu prosedür, toplanan partiküllerin değişik karakterizasyonları paralel yapılmasını sağlar. Burada sunulan yöntemin amacı, filtreler çıkarılır, biyo-aerosolleri endotoksin ve DNA içeriği son derece doğru ve güvenilir bir analiz sağlamaktır. örnek filtrelerden Lipopolisakkaridler gibi yüksek moleküler ağırlıklı organik moleküllerin, ekstraksiyonu pirojensiz su bazlı ortam içinde örnek çalkalama içerir. Daha sonra yapılan analiz bir türbidimetrik ölçümü kullanılarak tespit edilebilir bir enzimatik reaksiyona dayanır. örneklenmiş filtreler üzerindeki yüksek organik içeriğin bir sonucu olarak, örneklerden DNA ekstraksiyon ilk topraklar için tasarlanmış ve DNA verimi artırmak için modifiye edilmiş bir ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Algılama ve kantitatif polimeraz zincir Reacti kullanarak belirli mikrobiyal türlerin miktar(Q-PCR) analizi tarif diğer yöntemlerden karşılaştırılmıştır.
Introduction
Filtrelerin hava örnekleme atmosferik aerosoller araştırma temel araçtır. 1 örneklenmiş filtreler çeşitli kimyasal, fiziksel ve toplanan çevre parçacıkların biyolojik karakterizasyonları için başlangıç noktasıdır. 2-11 Bu yaklaşımın avantajı çeşitli analizler olabilmesidir aynı numune üzerinde off-line gerçekleştirilir. Araştırmacı tüm farklı analizler verileri etkinleştirir derlenmesi atmosfer bilimleri karmaşık sorunların çözümünde toplanan parçacıkların ve yardımların özelliklerinin iyi bir anlayış elde etmek için. 12,13 Örneğin, deniz ve iç hava örnekleri aynı sırasında alınan süresi Bu çalışma için örnek partikül toksisite ve biyolojik kompozisyon. 14 ile ilgili olarak karşılaştırılabilir, lipopolisakarit (LPS), aynı zamanda endotoksinlerin şekilde bilinmektedir gram-negatif bakteri hücre duvarları, bileşenler, kıyı-ve örneklendiği filtrelerden ekstre edildi bir iç site ve kullanılarak değerlendirildilimulus amebocyte lizat (LAL) testi. Buna paralel olarak, bakteriyel içeriğin bir genomik değerlendirme (toplam bakteri, gram negatif ve siyanobakteri kantitatif) polimeraz zincir reaksiyonu (Q-PCR) kullanılarak aynı numune üzerinde gerçekleştirilmiştir. LAL Test endotoksin içeren bir sulu çözeltiye, at nalı yengeç, Limulus Polyphemus'un gelen amebocytes sulu ekstraktının ilave edildikten sonra oluşan bulanıklık ölçümlerine dayanır. Örnek yüksek endotoksin konsantrasyonu hızlı türbidite geliştirir. 15 Q-PCR analizi, belirli bir DNA fragmanı amplifiye olarak yayılan bir floresan sinyali dayanır. 16 sinyal gerçek zamanlı izleme PCR üslü fazda standart bir eğri ile reaksiyonu ve kalibre, ilk DNA miktar olarak tespit edilebilir. Bu ikisinin kombinasyonu başka bir yerde ayrıntılı olarak, 14 endotoksin ve düzeyleri iyi bir tahmin sağlayabilir, diğerleriyle birlikte analizleriörneklerinde, kaynak bakteri miktarı.
Burada sunulan yöntemin amacı, filtreler çıkarılır, biyo-aerosolleri endotoksin ve DNA içeriği son derece doğru ve güvenilir bir analiz sağlamaktır. Aerosol fiziksel ve inorganik kimyasal özellikleri örnekleme yöntemleri ve daha yakın zamanda, yöntemler organik madde bileşeni araştırmak için geliştirilmiştir iyi bilinen iken, 17 aerosollerin biyolojik bileşeni yetersiz araştırma olmuştur. 18 akımı gerekçesi yöntem ayrıntılı olarak, ayıklanması analiz ve havadaki aerosoller biyolojik kısmını tanımlamak için sağlam bir yöntem sunarak bu boşluğu doldurmak için. 14
Burada açıklanan yöntem filtre analizini içeren biyolojik kapalı ve açık aerosol araştırma projelerinde yaygın kullanım alanı bulur bekleniyor. 20-24
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma Filtreler üzerinde toplanan aerosol örneklerinde endotoksin ve DNA hediyesi hem ölçülmesi için çıkarma ve algılama yöntemleri anlatılmaktadır. yöntemler doğru rutinleri gerektiren ve uzun Deneyciler Burada tartışılan birkaç temel ve önemli noktaları yapışır gibi kolayca yapılabilir.
endotoksin algılama adım için, lizat çözüm oldukça viskoz ve pipetleme üzerine kabarcıkları üretmek eğiliminde olduğunu unutmayın. Sana kabarcıklar kaldırmak …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
References
- Lodge, J. P. J. . Methods of Air Sampling and Analysis. , (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. . Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children’s classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. . Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. , (2011).
- Vincent, J. H. . Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O’Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O’Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D., Hodges, N., Hanlon, G. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. , 12.1-12.15 (2003).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. . Brock Biology of Microorganisms. , (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. . Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. . PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
