L'analyse du filtre à air dans l'échantillon d'endotoxines et de l'ADN contenu
Summary
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
la recherche d'aérosol extérieure utilise couramment les matières particulaires échantillonné sur les filtres. Cette procédure permet à diverses caractérisations des particules collectées à effectuer en parallèle. Le but de la méthode présentée ici est d'obtenir une analyse très précise et fiable de l'endotoxine et l'ADN contenu des bio-aérosols extraits de filtres. L'extraction de poids moléculaire élevé des molécules organiques, telles que des lipopolysaccharides, des filtres échantillonnés consiste à secouer l'échantillon dans un milieu à base d'eau exempte de pyrogènes. L'analyse qui suit est basée sur une réaction enzymatique qui peut être détectée au moyen d'une mesure turbidimétrique. En conséquence de la teneur organique élevée sur les filtres de l'échantillon, l'extraction de l'ADN à partir des échantillons est effectuée en utilisant un kit d'extraction d'ADN du commerce qui a été conçu à l'origine pour les sols et modifié pour améliorer le rendement de l'ADN. La détection et la quantification des espèces microbiennes spécifiques à l'aide Reacti en chaîne par polymérase quantitativesur (q-PCR) sont décrits et par rapport aux autres méthodes disponibles.
Introduction
Des prélèvements d'air sur les filtres est un outil de base dans la recherche sur les aérosols atmosphériques. 1 Les filtres échantillonnés sont le point de départ pour diverses caractérisations biologiques des particules ambiantes recueillies chimiques, physiques, et. 2-11 L'avantage de cette approche est que différentes analyses peuvent être effectuée hors ligne sur le même échantillon. Compiler les données de toutes les différentes analyses permet au chercheur d'obtenir une bonne compréhension des caractéristiques des particules collectées et les aides à la résolution des questions complexes dans les sciences de l' atmosphère. 12,13 Par exemple, l' air-échantillons marins et intérieures prises au cours de la même période peut être comparé en ce qui concerne la toxicité des particules échantillonnée et la composition biologique. 14 pour cette étude, les lipopolysaccharides (LPS), des composants sur bactériennes parois cellulaires gram-négatives, également connu sous endotoxines ont été extraites des filtres échantillonnés à terre et à un site intérieur, et ont été évalués en utilisant lelimule amébocyte lysat (LAL). En parallèle, une évaluation génomique de la teneur en bactéries (bactéries totales, Gram-négatives, et les cyanobactéries) a été effectuée sur le même échantillon en utilisant la réaction en chaîne par polymérase quantitative (Q-PCR). Le test LAL est basée sur des mesures de turbidité formées suite à l'ajout d'un extrait aqueux de amœbocytes de la limule, Limulus polyphemus, à une solution aqueuse contenant les endotoxines. Plus la concentration d'endotoxine dans l'échantillon, la turbidité se développe rapidement. 15 L'analyse Q-PCR est basée sur un signal de fluorescence émis sous forme d' un fragment spécifique d'ADN est amplifiée. 16 Par suivi en temps réel du signal pendant la phase exponentielle de la PCR réaction et étalonnage avec une courbe standard, la quantité d'ADN initial peuvent être quantifiés. La combinaison de ces deux analyses avec d' autres, comme détaillé ailleurs, 14 peuvent fournir une bonne estimation des niveaux d'endotoxines et de laquantité de bactéries d'origine dans les échantillons.
Le but de la méthode présentée ici est d'obtenir une analyse très précise et fiable de l'endotoxine et l'ADN contenu des bio-aérosols extraits de filtres. Bien que les méthodes d'échantillonnage des caractéristiques physico – chimiques et inorganiques des aérosols sont bien connus et, plus récemment, des méthodes ont été développées pour enquêter sur sa composante de matière organique, 17 il y a eu peu de recherches sur la composante biologique des aérosols. 18 La raison pour laquelle le courant méthode consiste à combler cette lacune en présentant en détail une méthode robuste pour extraire, analyser et identifier la fraction biologique des aérosols atmosphériques 14.
La méthode détaillée ici devrait trouver une large utilisation dans les projets intérieurs et extérieurs biologiques aérosol recherche impliquant l' analyse du filtre. 20-24
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet ouvrage décrit les méthodes d'extraction et de détection pour quantifier les endotoxines et de l'ADN présent dans des échantillons d'aérosols collectés sur des filtres. Les méthodes nécessitent des routines précises et peuvent être réalisées facilement aussi longtemps que l'expérimentateur adhère à quelques points essentiels et importants discutés ici.
Pour l'étape de détection d'endotoxine, notons que la solution de lysat est tout à fait visqu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
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