Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.
Alfa-sinüklein (α-sin) proteini bol esas olarak nöronlar içinde ifade edilir ve farklı şekillerde bir dizi mevcut olduğu – monomerler, tetramerler, oligomerler ve fibrillerin. Hastalık sırasında, α-sin proteini daha fazla sayıda çözünmez hale getirme eğiliminde oligomerleri ve yüksek moleküler ağırlıklı agregaların meydana getirmek üzere uygun değişikliklere uğrar. Anormal toplu α-sin Parkinson hastalığı (PH), Lewy organları (LCD) ve çoklu sistem atrofisi (MSA) ile demans nöropatolojik özelliğidir. Biyokimyasal karakterizasyon ve artan deterjan gücü ve yüksek hızda ultrasantrifüjleme ile çözünmez α-syn kullanarak tamponların analiz hastalığın ilerlemesi ile ilişkili α-sin patolojinin gelişimini belirlemek için güçlü bir araç sağlar. Bu protokol ölüm sonrası insan beyin dokusunun giderek çözülmez / toplu α-syn izolasyonunu anlatmaktadır. Bu metodoloji, normal ve anormal a çalışmalarına değişikliklerle uyarlanabilirFarklı α-syn mutasyonlar barındıran transgenik hayvan modellerinde hem de ilgili patolojileri ile ilişkili proteinlerin anormal, fibriler birikintilerin, özelliği diğer nörodejeneratif hastalıklarda -SYN biyolojisi.
Birçok nörodejeneratif hastalıklar arasında ortak anahtarı, patolojik özelliklerinden biri bir protein / hastalığın spesifik bir şekilde 1 oluşur anormal protein agregalarının oluşmasıdır. Böylece, Alzheimer hastalığı (AH) nöronların içindeki karakteristik ekstranöronal amiloid beta plaklar ve toplulaştırılmış hiperfosforile tau mevduat vardır; Lewy Bodies intranöronal kapanımlar olan (Liderler), ve ayrıca Lewy neurites (LN) Lewy organları (DLBs) 2-4 ile PD PD demans ve Demans denilen distrofik nöronal süreçleri içinde toplu α-syn mevduat. Anormal α-syn mevduat da MSA 5 glial sitoplazmik inklüzyonlar damgasını lezyonlar görülür. Huntington hastalığında, orada karakteristik Poly-Q yatakları ve anormal Tar DNA protein-43 ve sarkom proteinleri (FUS) erimiş Frontotemporal demanslar biriken bağlayıcı. Önemli olarak, PD, α-sin geni mutasyonları Cau bulunmuşturPD 6-11 dominant se otozomal. Ayrıca, α-sin gen triplication 12 ve çoğaltılması 13 de böylece PD patomekanizmaların artan α-sin ifadesini bağlayan ailesel PD neden olur. Özellikle, ailesel ve sporadik hem PD olgular α-sin patoloji 14 anormal mevduat liman. PD Güncel mevcut tedaviler palyatif sadece ve durdurma ya da amansız bir hastalık ilerlemesini geciktirmek üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
α-sin bol insan beyninde ifade ve toplam beyin proteininin yaklaşık% 1'ini yapar. Bu nöronların içindeki daha özel olarak mevcut ancak glial hücreleri içinde daha düşük miktarlarda da olsa var olabilir. Bir tartışmalı nokta rastgele bir monomer 15 veya katlanmış bir tetramer 16 olarak var olabilir α-syn yerli yapıdır. Hastalık sırasında, α-sin o katlanan almayı sağlar şeklini değiştirir ve bu süreç hastalığın pathoge neden olduğu düşünülmektedirNesis. Α-syn ve hastalığın patofizyolojik yönlerini içine soruşturma birkaç yıl olmasına rağmen, hastalık mekanizmaları kesin nedenleri 14 zor kalmıştır.
Parkinson beyinlerin otopsi analizleri kullanılarak yapılan çalışmalar bugüne kadar α-syn sporadik PH ve aynı zamanda hem LRRK2 gen 17-22 mutasyonlarla ilişkili PD normal ve anormal biyoloji ile ilgili önemli ipuçları vermiştir. Burada, çeşitli derecelerde α-syn agrega liman insan post-mortem PD beyin dokusunda giderek çözünmez α-syn mevduatlar için bir biyokimyasal çıkarma protokolü (bkz şeması Şekil 1'de sunulan) tarif edilmiştir. Bu teknik aynı zamanda diğer nörodejeneratif hastalıklar 23,24 için ortalama proteinleri çalışma tamponu bileşimlerinde değişikliklerle ve aynı zamanda transgenik hayvan beyin dokusu 25-27 den adapte edilebilir. Uyarlamalar ana dikkate solubi farklılıklar vardırğı ve bazıları, ilgili proteinlerin toplam miktarları, esasen, nükleer ve FUS 28 için gösterildiği gibi, en uygun çıkarılması için yüksek tuzlu tampon gerekebilir.
Bu makale denatüre jel çalışma koşulları kullanılarak hastalıklı beyinleri ekstraksiyon ve monomerik, oligomerik diferansiyel çözünürlük özelliklerinin incelenmesi ve kümelenmiş α-syn için biyokimyasal protokol tanımlamaktadır. Bu çalışma için iyi bilinen bir tekniktir toplu α-sin 17, 18, 20, 21 kendi doğal formunda normal eriyebilir ancak hastalığın ilerlemesi ya da genetik mutasyon amiloidojenik veya yüksek çekiş özelliklerinin elde protein. Bununla birlikte, bazı grupları (8 veya% 10 yerine% 5%) 21,22, 30. SDS α-sin membran bağlanmış form içerebilir oligomerler, bir anyonik deterjan ve çözünürleştiren onların tampon SDS konsantrasyonlarında hafif varyasyonlar kullanmış α-sin, üre, oysa kaotropik reaktifi α-syn 20 çözünmeyen toplanmış ve fibriler veya amiloidojenik formları denatüre. Bu bağlamda Paleologou ark 31 tarafından sistematik bir çalışma istikrar incelendiα-syn oligomerler ve üre değişen konsantrasyonları ile fibrillerin (6,5-8 M) ya da SDS (0,25-2%) ve rapor üre konsantrasyonu yüksek olan SDS konsantrasyonlarda stabil ama oligomerleri. Α-syn oligomerler ve fibriller için spesifik onların FILA-1 antikoru, denatüre edici olmayan koşullar altında 6,5 M üre konsantrasyonlarında fibrillerin yüksek konsantrasyonlarda tespit edilmiştir. Bu protokolde kullanılan tampon konsantrasyonlarının yakın Culvenor et al edilmiştir ne yansıtır. (1999) 32.
Çözünmez α-syn biyokimyasal çıkarılması için anatomik beyin bölgelerinin özenle seçilmiş olmalı ve bu hastalığın ilerlemesi 33,34 bağlı α-syn LB ve LN yükünü yansıtmalıdır. Burada kullanılan vakalar McKeith göre PD ilerlemesinin geç ve bir ara aşamadan yansıtan PD neokortikal ve limbik alt tipleri gelen bazal ganglion örnekleri 34 ctriteria vardır. Kraliçe Meydanı Beyin Bank, beynin bir yarısırutin histokimyasal analizler için formalin sabit ve diğer yarısı dikkatle farklı anatomik bölgelere içine disseke ve flaş dondurulmuş ve biyokimyasal ileri ve DNA / RNA analiz çalışmaları için -80 oC dondurucular saklandı. Nöropatolog tarafından beyinleri ve diseksiyon formalin fiksasyonu takiben, immunhistokimya arşivlenmiş α-syn antikoru ve sonuçları kullanılarak yapılır. Ayrıca rutin olarak, beyin dokusunun pH değerinin, beyin dokusunun agonal durumunun bir ölçüsü olarak girişte ölçülür. Bu biyokimyasal analiz için doku koruma kalitesi için sağlam bir temel oluşturur.
Bizim burada verileri daha SDS kontrollere göre PD durumlarda çözünür α-sin monomer olduğunu göstermektedir; Özellikle Neokortikal PD olgular limbik PD çeşitli kıyasla daha yüksek α-sin yükü vardır. Neokortikal vakalar gibi frontal ve parietal cor olarak neokortikal bölgelerdeki PD α-sin patolojinin daha ilerlemesini temsil33,34 göçmenlik ve. Limbik PD olgular amigdala, transentorhinal ve singulat bölgeleri olarak bazal ön beyin / limbik bölgelerde alanlarda yüksek LB puanları. Anlamlı veriler ve istatistiksel analiz için birer kohorttaki en az 4 vaka çalıştırmanız gerekir. Aynı şekilde biz burada sunulan leke verilerinin istatistiksel analizini teşebbüs değil.
Aynı zamanda farklı antikorlar farklı biçimler / yüksek mertebeden α-syn oligomerler bileşimini tanıyabilir ve her biri kendi nispi hassasiyet ve tercih olabilir belirtmek gerekir. 4 farklı α-sin antikorlar (Syn-1, BB, Onco ve LB509) α-sin oligomerler / agrega en az değişmektedir sonuç verir olduğunu göstermektedir burada Tong ve ark., 29 sonuçlarından açıkça görülmektedir. Bu α-syn antikoru epitop ya N-terminal veya C bulunur bağlı olarak varyasyon rağmen α-syn monomerler Tüm 4 antikorlar tarafından benzer oranlarda kabul edildi29 terminal. Türler 20,21 sinüklein α-Benzer şekilde, fosfo-spesifik antikorlar, alfa sinüklein farklı yüksek moleküler ağırlıkların belirlenmesi. Burada anlatılan protokolde, yüksek özelliğine sahip antikor Syn-1 19-21 kullanılmıştır.
Ancak, bu hücrelerde aynı zamanda proteinin aşırı ekspresyonunu ve demonte antikoru preabsorption deneyleri ile western blot üzerinde yeni antikor doğrulama ve dikkate alınması önemlidir.
Bu α-sin ve veya stabil olmayan dörtlü α-sin formların küçük fragmanlarının belirlenmesi için araştırmacılar tarafından uygulanmış olan diğer varyasyonlar dikkate alınması önemlidir. Bu tetramerleri 36 stabilize α-syn 35 veya çapraz bağlama maddeleri ile Örnek homojenatlarında tedavisinde tepe bölümü kesik biçimlerinde korumak için PBS içinde% 0.4 PFA ile membran hafif tespit içerebilir.
Otopsi TI kullanarak proteinlerin doğru biyokimyasal değerlendirmessue enzimatik protein yıkımı ve modifikasyon minimize gerektirir. Bu durum kohortlardan içinde eşleştirilmiş örnekler kısa otopsi gecikme ile doku kullanabilir ve / veya seçmek için bu nedenle tavsiye edilir. Α-sin immünohistokimya standart antikorlar kullanılarak immünohistokimya yalıtım protokolü başlamadan önce yapılmalıdır. Α-sin patolojinin ölçüde oldukça değişkendir ve seçilen bölgelere göre değişebilir. Her çalışma ile optimum verim için bir pozitif kontrol olarak bol patoloji bölgeleri seçmek için tavsiye edilir. Gerekli fosfataz inhibitörleri, proteaz inhibitörleri ve gerekirse kullanımı hücre lizizi sırasında meydana gelen ve 4 ° C 'de muhafaza örnekleri hücre içi proteazlar ya da fosfatazların serbest bırakıldıktan sonra önemlidir İstenmeyen enzimatik bozunmasını önlemek için.
Bu deneylerin toplu iş içinde numunelerin içi kullanıcı varyasyonları önlemek için eşit ve düzenli işlenir önemlidir; Birden çok frebu potansiyel fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlarını geri olabilir eze-eritme çevrimleri kaçınılmalıdır. Numunelerin çok sayıda inceleyen immunoblotlarda veri jelleri diğer tüm örneklerin ve bu örneğe başvurulan tüm verilere paralel olarak çalışmalıdır bir örnek, normalize olması gerektiğini olduğunda bir kritik nokta akılda tutulması. Bu birkaç blotlar arasındaki immunoblot verilerinin normalleşmesini sağlamak için yapılır. Bu bizim son çalışmada 22 benimsenen yöntemdir.
Düşük arka plan ECL tutmak için, benekler western blot protokolü esnasında herhangi bir zamanda kurumasına izin verilmesi gerektiği not edilmelidir. Bu ECL sinyalinin doygunluk yol açacaktır ve yanlış kantitatif yol açacaktır ek olarak, otoradyografi filmlerde çok uzun pozlama (> 10 dk) kaçınılmalıdır.
Bu, yukarıda protokol ortak laboratuvar reaktifler ve kullanılan oldukça basit bir tekniktirKumanda elemanları ve PD araştırma α-syn proteinin patofizyoloji araştırmak için değerli bir araç olabilir. Bu metodoloji, sadece α-sin transgenik hayvanlarda α-sin biyolojisi çalışmalarına uygun modifikasyonlar ile değil, aynı zamanda, AD, MSA, DLB, HD ve frontotemporaldementias gibi kümelenmiş proteinlerin anormal mevduat sahip diğer nörodejeneratif bozukluklar ile uzatılamaz. Ancak, burada tarif edilen Western blot verileri de α-syn 31 ile ilgili spesifik formlar için antikorlar kullanılarak enzim bağlı immünosorbent deneyleri kullanılarak onaylayabilir.
The authors have nothing to disclose.
I thank Dr Adamantios Mamais for extracting α-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson’s Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.
Tris-HCL | Sigma | T5912 | |
sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
SDS | Fluka | 71727 | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Protease inhibitor tablets | Roche | 04 693 116001 | |
Phosphatase inhibitor tablets | Roche | 04 906 837001 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | P4417 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
NuPAGE MOPS SDS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
NuPAGE transfer buffer | Invitrogen | NP0006-1 | |
Hybond-P membrane | GE Healthcare | RPN303F | |
Whatman 3MM filter paper | Sigma | WHA30306185 | |
Bis-tris gels 4-12% | Invitrogen | NP0322BOX | |
Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
Bio-RAD DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | |
Thickwall Beckman Polycarbonate tubes | Beckman | 355630 | |
Western blot stripping buffer | Thermo scientific | 46430 | |
Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 610786 | |
beta-actin primary antibody (mouse monoclonal | Sigma | A5441 | |
HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody | Santa Cruz | sc-2031 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
Instrument | Company | Rotor/ model no | |
Benchtop Ultracentrifuge Optima Max | Beckman | MLA-80 | |
Sonicator | Heat Systems | XL20-20 | |
Homogeniser | Jenke and Kunkel | TP18/10 |