استخراج متتابعة من القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان ألفا Synuclein من أدمغة الشلل الارتعاشي
Summary
Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.
Abstract
ألفا synuclein وأعربت (α-اصطناعي) البروتين بكثرة أساسا داخل الخلايا العصبية، وتوجد في عدة أشكال مختلفة – أحادية، tetramers، oligomers والألياف. أثناء المرض، α-اصطناعي يخضع لتغيرات متعلق بتكوين تشكيل oligomers وارتفاع المجاميع الوزن الجزيئي التي تميل إلى جعل البروتين أكثر غير قابلة للذوبان. بشكل غير طبيعي مجمعة α-اصطناعي هو سمة من سمات عصبية مرضية من مرض باركنسون (PD)، والخرف مع الهيئات ليوي (DLB) وضمور في النظام المتعدد (MSA). توصيف وتحليل غير قابلة للذوبان مخازن-SYN α باستخدام مع زيادة قوة المنظفات وعالية السرعة تنبيذ فائق الكيمياء الحيوية ويوفر أداة قوية لتحديد وتطوير علم الأمراض α-اصطناعي يرتبط تطور المرض. يصف هذا البروتوكول عزلة غير قابلة للذوبان متزايد / مجمعة α-اصطناعي من بعد الوفاة أنسجة المخ الإنسان. هذه المنهجية يمكن تكييفها مع بعض التعديلات لدراسات α العادية وغير العاديةعلم الأحياء -syn في النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا إيواء مختلفة الطفرات SYN α وكذلك في الأمراض العصبية الأخرى التي تتميز الودائع ييفي الشاذة من البروتينات المرتبطة بأمراض كل منها.
Introduction
واحدة من السمات المرضية رئيسية مشتركة بين عدة أمراض الاعصاب هو تشكيل المجاميع البروتين الشاذة التي تحدث في بروتين / المرض بطريقة محددة 1. وبالتالي، هناك المميزة extraneuronal ويحات أميلويد بيتا والمجمعة ودائع تاو hyperphosphorylated داخل الخلايا العصبية في مرض الزهايمر (AD)؛ ودائع-α SYN المجمعة في الهيئات ليوي (LBS) التي هي شوائب داخل العصبون، وكذلك في عمليات التصنع الخلايا العصبية تسمى neurites التي ليوي (LNS) في PD، PD العته والخرف مع الهيئات ليوي (DLBs) 2-4. وتعتبر الودائع α SYN غير طبيعية أيضا في آفات مميزة لالادراج السيتوبلازمية الدبقية في MSA 5. في مرض هنتنغتون، هناك المميزة الودائع بولي-Q، وغير طبيعي القطران DNA ملزمة تودع البروتين 43 و تنصهر في البروتينات ساركوما (الفتح) في الخرف الجبهي الصدغي. الأهم لPD، تم العثور على الطفرات الجينية α-اصطناعي لالكمنولثحد ذاته جسمية مهيمنة PD 11/06. بالإضافة إلى ذلك، α-اصطناعي triplication الجين 12 و 13 الازدواجية يسبب أيضا PD العائلية التي تربط ما بين زيادة التعبير α-SYN إلى pathomechanisms من PD. والجدير بالذكر أن الحالات PD كلا متفرقة والعائلية تؤوي الودائع غير طبيعية من α-اصطناعي علم الأمراض (14). العلاجات المتاحة حاليا للPD هي مسكن فقط وليس لها أي تأثير على وقف أو تأخير تطور المرض لا يرحم.
α-اصطناعي وأعرب عن بوفرة في الدماغ البشري وتشكل حوالي 1٪ من البروتين في الدماغ الكلي. كان موجودا على نحو أكثر تحديدا في الخلايا العصبية ولكن يمكن أن توجد ولو بكميات أقل داخل الخلايا الدبقية. وهناك نقطة خلافية هي الهيكل الأصلي للα-SYN التي يمكن أن توجد كما مونومر عشوائي 15 أو في شكل tetramer مطوية 16. أثناء المرض، α-اصطناعي يتغير التشكل التي تتيح لها الحصول تتجمع ويعتقد لهذه العملية أن تكون سببا في pathoge المرضnesis. على الرغم من عدة سنوات من التحقيقات في الجوانب المرضية في جسم المريض من α-اصطناعي والمرض، وظلت الاسباب الحقيقية لآليات المرض بعيد المنال 14.
دراسات باستخدام التحليل بعد الوفاة من أدمغة الشلل الارتعاشي وفرت حتى الآن ادلة هامة بشأن البيولوجيا العادية وغير العادية لل-α SYN سواء في PD متفرقة وأيضا PD المرتبطة الطفرات في الجين LRRK2 17-22. هنا، وقد وصفت بروتوكول استخراج الكيمياء الحيوية (انظر المخطط الوارد في الشكل 1) للودائع-α SYN غير قابلة للذوبان متزايد من بعد الوفاة الأنسجة PD الدماغ التي تأوي المجاميع α-SYN بدرجات متفاوتة. ويمكن أيضا أن هذا الأسلوب يمكن تكييفها مع بعض التعديلات في التراكيب عازلة لدراسة البروتينات الكلية من الأمراض العصبية الأخرى 23،24 وأيضا من الحيوانات المعدلة وراثيا أنسجة المخ 25-27. والاعتبار الرئيسي للتكييفات هي الاختلافات في solubiعنه lity والمبالغ الإجمالية للبروتينات منها بعض منها هي أساسا النووي، وربما تحتاج مخازن عالية من الملح لاستخراج الأمثل كما هو مبين على الفتح 28.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة بروتوكول الكيمياء الحيوية لاستخراج وفحص الخصائص التفاضلية ذوبان مركب بسيط، بلازميدة قليلة القسيمات وتجميع α-اصطناعي من العقول المريضة باستخدام تغيير طبيعة الظروف هلام التوالي. هذا هو أسلوب راسخة لدراسة مجمعة α-اصطناعي 17، 18، 20، 21 بروتينا عادة قابل للذوبان في شكله الأصلي لكن كسب amyloidogenic أو زيادة خصائص التجميع مع تطور المرض أو مع الطفرات الجينية. ومع ذلك، استخدمت بعض الجماعات اختلافات طفيفة في تركيزات SDS في المخازن الخاصة بهم (8٪ أو 10٪ بدلا من 5٪) 21،22، 30، وSDS هو المنظفات أنيوني وsolubilises α-SYN oligomers التي يمكن أن تشمل غشاء ملزمة أشكال α-اصطناعي، في حين اليوريا، وكاشف chaotropic يبدل طبيعة الأشكال المجمعة وييفي أو amyloidogenic غير قابلة للذوبان من α-اصطناعي 20. وفي هذا الصدد تناولت دراسة منهجية Paleologou وآخرون 31 استقرارمن oligomers-SYN α والألياف مع تركيزات مختلفة من اليوريا (6،5-8 M) أو SDS (،25-2٪) وذكرت أن oligomers مستقرة في تركيزات SDS لكن ليس مع تركيزات عالية من اليوريا. من فيلا-1 الأضداد ومحددة لoligomers-SYN α والألياف الكشف عن تركيزات أعلى من الألياف بنسبة 6.5 M تركيزات اليوريا في ظل ظروف غير تغيير طبيعة. تركيزات العازلة المستخدمة في هذا البروتوكول يعكس عن كثب ما تم وصفه في Culvenor وآخرون. (1999) 32.
مناطق الدماغ التشريحية لاستخراج البيوكيميائية غير قابلة للذوبان α-اصطناعي يجب اختيارها بعناية وهذا ينبغي أن تعكس LB وLN تحميل ألفا-SYN اعتمادا على تطور المرض 33،34. الحالات المستخدمة هنا هي عينات العقد القاعدية من الأنواع الفرعية القشرة المخية الحديثة والحوفي من PD تعكس المراحل المتأخرة والمتوسطة من التقدم PD وفقا لMcKeith ctriteria 34. في الضفة ساحة الملكة الدماغ، نصف الدماغالثابتة بشكل روتيني في الفورمالين لتحليلها النسيجية وتشريح النصف الآخر بعناية في المناطق التشريحية المختلفة وفلاش تجميد وتخزينها في -80 س C المجمدات لمزيد من الكيمياء الحيوية والحمض النووي دراسات تحليل / RNA. بعد التثبيت الفورمالين من العقول وتشريح من قبل neuropathologists، المناعية تتم باستخدام الأجسام المضادة α-اصطناعي والنتائج المؤرشفة. أيضا كإجراء روتيني، يتم قياس درجة الحموضة في نسيج المخ لدى وصوله كمقياس للدولة احتضارية من أنسجة المخ. وهذا يشكل أساسا متينا لنوعية الحفاظ على الأنسجة لتحليل الكيمياء الحيوية.
لدينا البيانات هنا تبين أن هناك المزيد من SDS ذوبان مونومر α-اصطناعي في حالات PD مقارنة مع الضوابط. ولا سيما الحالات PD القشرة المخية الحديثة لديها أعلى حمولة α-اصطناعي مقارنة متنوعة PD الحوفي. حالات القشرة المخية الحديثة تمثل تطور أكبر من PD-α اصطناعي علم الأمراض في مناطق القشرة المخية الحديثة مثل الجبهي والجداري كوراملمارسات 33،34. الحالات PD الحوفي لديها أعلى الدرجات LB في مناطق الدماغ الأمامي / المناطق الحوفي القاعدية مثل اللوزة، transentorhinal والمناطق الحزامية. للبيانات ذات مغزى والتحليل الإحصائي، لا بد من تشغيل 4 حالات على الأقل من كل فوج. وبالمثل نحن لم يحاولوا التحليل الإحصائي للبيانات وصمة عار المقدمة هنا.
كما يجب الإشارة إلى أن الأجسام المضادة المختلفة قد يتعرف أشكال مختلفة / تكوين العالي أجل α-SYN oligomers ومنها قد يكون له حساسيته النسبية الخاصة وتفضيل. وهذا واضح من نتائج تونغ وآخرون. 29 حيث تبين أن 4 الأجسام المضادة α SYN مختلفة (SYN-1، SS، الأدوية السرطانية وLB509) تعطي نتائج قابلة للتغيير على الأقل ل-α SYN oligomers / الركام. وقد اعترفت أحادية α-اصطناعي بدرجات مماثلة من قبل جميع الأجسام المضادة 4 على الرغم من أن هذه يمكن أن يكون اختلاف اعتمادا على ما إذا حاتمة الضد-α SYN يقع إما في N-محطة أو C-terminal 29. وبالمثل، والأجسام المضادة المحددة لالفوسفات ألفا تحديد synuclein متميزة الوزن عالية الجزيئية α-synuclein الأنواع 20،21. في بروتوكول الموصوفة هنا، والأجسام المضادة تتميز غاية SYN-1 وقد استخدم 19-21.
ومع ذلك، فمن المهم النظر في التحقق من صحة أي الأجسام المضادة جديد على البقع الغربية من خلال الأجسام المضادة التجارب preabsorption وأيضا overexpression وضربة قاضية من البروتين في الخلايا.
من المهم أن تنظر الاختلافات الأخرى التي تم تطبيقها من قبل الباحثين لتحديد أجزاء أصغر من أشكال α SYN وأو رباعي القسيمات غير مستقرة α-SYN. ويمكن أن يشمل معتدل التثبيت من الأغشية مع 0.4٪ PFA في برنامج تلفزيوني للاحتفاظ أشكال اقتطاع من α-اصطناعي 35 أو علاج الخليط عينة مع linkers عبر لتحقيق الاستقرار tetramers 36.
تقييم البيوكيميائية دقيق من البروتينات باستخدام ما بعد الوفاة منظمة الشفافية الدوليةيتطلب ssue التقليل من تدهور البروتين الأنزيمي والتعديل. ولذلك فمن المستحسن استخدام الأنسجة مع أقصر تأخير بعد الوفاة و / أو اختيار عينات مطابقة ضمن الأفواج القضية. المناعية باستخدام أجسام مضادة القياسية لα-اصطناعي المناعية يجب أن يتم تنفيذ قبل البدء في بروتوكول العزلة. مدى α-اصطناعي أمراض متغير بدرجة كبيرة ويمكن أن تختلف وفقا لمناطق مختارة. فإنه من المستحسن لتحديد المناطق يعانون من أمراض وفيرة كوسيلة لمراقبة إيجابية للالعائد الأمثل مع كل تشغيل. استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني، وإذا مثبطات إنزيم الفوسفاتيز ضروري لمنع تدهور الأنزيمية غير مرغوب فيه بعد الافراج عن البروتياز داخل الخلايا أو الفسفاتازات التي تحدث أثناء تحلل الخلايا والحفاظ على العينات عند 4 ° C أمر حاسم.
ومن المهم أن جميع العينات ضمن مجموعة من التجارب يتم التعامل معها بالتساوي وباستمرار لتجنب الاختلافات داخل المستخدم؛ الصحائف متعددةوينبغي تجنب دورات إز ذوبان الجليد لأن هذا قد يحتمل التراجع عن التعديلات بعد متعدية مثل الفسفرة. وهناك نقطة حاسمة لنأخذ في الاعتبار عند النظر في عدد كبير من العينات غير أن البيانات من immunoblots يجب أن تكون طبيعية لعينة واحدة، والتي يجب أن تعمل بالتوازي لجميع العينات الأخرى على المواد الهلامية، وجميع البيانات المشار إليها إلى أن العينة. ويتم ذلك لضمان تطبيع البيانات طخة مناعية بين عدة البقع. هذا هو الأسلوب المعتمد في دراستنا الأخيرة (22).
وتجدر الإشارة إلى أنه من أجل الحفاظ على ECL خلفية منخفضة، لا ينبغي أن يسمح البقع لتجف في أي وقت خلال بروتوكول صمة عار الغربي. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي تجنب التعرض لفترة طويلة جدا (> 10 دقيقة) على أفلام تصوير الإشعاع الذاتي لأن ذلك سوف يؤدي إلى تشبع إشارة ECL وسيؤدي إلى الكميات غير دقيقة.
هذا البروتوكول أعلاه هي تقنية بسيطة نسبيا باستخدام الكواشف المخبرية المشتركة وفيstruments ويمكن أن يكون أداة قيمة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية من البروتين α-اصطناعي في مجال البحوث PD. لا يمكن تمديد هذه المنهجية فقط مع تعديلات مناسبة لدراسة البيولوجيا α-اصطناعي في الحيوانات المعدلة وراثيا α SYN ولكن أيضا لأمراض الاعصاب أخرى تتميز الودائع غير طبيعية من البروتينات المجمعة مثل AD، MSA، DLB، HD وfrontotemporaldementias. إلا أن البيانات طخة غربية الموصوفة هنا يمكن أيضا أن يتم التحقق من صحة باستخدام المقايسات المناعي المرتبط بالإنزيم باستخدام الأجسام المضادة لأشكال محددة من α-اصطناعي 31.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I thank Dr Adamantios Mamais for extracting α-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson’s Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.
Materials
| Tris-HCL | Sigma | T5912 | |
| sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
| SDS | Fluka | 71727 | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 04 693 116001 | |
| Phosphatase inhibitor tablets | Roche | 04 906 837001 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | P4417 | |
| Tween-20 | Sigma | P9416 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| NuPAGE transfer buffer | Invitrogen | NP0006-1 | |
| Hybond-P membrane | GE Healthcare | RPN303F | |
| Whatman 3MM filter paper | Sigma | WHA30306185 | |
| Bis-tris gels 4-12% | Invitrogen | NP0322BOX | |
| Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| Bio-RAD DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | |
| Thickwall Beckman Polycarbonate tubes | Beckman | 355630 | |
| Western blot stripping buffer | Thermo scientific | 46430 | |
| Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 610786 | |
| beta-actin primary antibody (mouse monoclonal | Sigma | A5441 | |
| HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody | Santa Cruz | sc-2031 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Instrument | Company | Rotor/ model no | |
| Benchtop Ultracentrifuge Optima Max | Beckman | MLA-80 | |
| Sonicator | Heat Systems | XL20-20 | |
| Homogeniser | Jenke and Kunkel | TP18/10 |
References
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, . M. A-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
- Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).
- Ahmed, Z., et al. The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy. Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).
- Ploymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276, 2045-2047 (1997).
- Kruger, R., et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson’s disease. Nat Genet. 18, 106-108 (1998).
- Zarranz, J. J., et al. The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia. Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).
- Proukakis, C., et al. A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease. Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).
- Kiely, A., et al. Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson’s disease and Multiple System atrophy?. Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).
- Lesage, S., et al. G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome. Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).
- Singleton, A. B., et al. Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302, 841 (2003).
- Chartier-Harlin, M. C., et al. Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364, 1167-1169 (2004).
- Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A. Genetic neuropathology of PD. Int J Clin Exp Pathol. 1 (3), 217-231 (2008).
- Fauvet, B., et al. α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer. J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).
- Bartels, T., et al. α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477, 107-110 (2011).
- Campbell, B. C., et al. Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies. Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).
- Campbell, B. C., et al. The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson’s disease. J Neurochem. 76, 87-96 (2001).
- Miller, D. W., et al. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson’s disease with SNCA locus triplication. Neurology. 62, 1835-1838 (2004).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
- Zhou, J., et al. Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).
- Mamais, A., et al. Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson’s disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases. Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).
- Lashley, T., et al. A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies. Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).
- Brelstaff, J., et al. Transportin-1: a marker of FTLD-FUS. Acta Neuropathol. 122 (5), 591-600 (2011).
- Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).
- Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136, 412-432 (2013).
- Tofaris, G. K., et al. Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders. J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Gallagher, S., Chakravarti, D. Immunoblot analysis . J Vis. Exp. (16), e759 (2008).
- Tong, J., et al. Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson’s disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation. Brain. 133, 172-188 (2010).
- Paleologou, K. E., et al. Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies. Brain. 132, 1093-1101 (2009).
- Culvenor, J. G., et al. Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited. American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).
- McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
- Lee, B. R., Kamitani, T. Improved immunodetection of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 6, e23939 (2011).
- Newman, A. J., et al. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 8 (11), e81314 (2013).
