JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Последовательное извлечение растворимых и нерастворимых Альфа-синуклеина из Паркинсона Brains

Published: January 05, 2016
doi:
10.3791/53415
1Reta Lila Weston Institute of Neurological Studies,UCL Institute of Neurology

Summary

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Abstract

Альфа-синуклеина (α-син) белок в большом количестве экспрессируется, главным образом, в нейронах, и существует в нескольких различных форм – мономеров, тетрамеров, олигомеров и фибрилл. Во заболевания, α-син претерпевает конформационные изменения с образованием олигомеров и агрегатов высокие молекулярной массой, которые имеют тенденцию превращать протеин в более нерастворимые. Аномально агрегированный α-син является невропатологических особенностью болезни Паркинсона (БП), деменции с тельцами Леви (DLB) и множественной системной атрофии (MSA). Биохимический анализ характеристик и нерастворимых альфа-син, используя буферов с увеличением силы моющих средств и высокоскоростной ультрацентрифугированием обеспечивает мощный инструмент для определения развития α-син патологии, связанной с прогрессированием заболевания. Этот протокол описывает выделение более нерастворимого / агрегированной а-син из посмертного человеческого головного мозга ткани. Эта методика может быть адаптирована с изменениями в исследованиях нормального и аномального альфа-syn биологии в трансгенных животных, несущих моделей различных альфа-син мутации, а также в других нейродегенеративных заболеваний, которые показывают аберрантных фибриллярных отложений белков, связанных с их соответствующими патологий.

Introduction

Одним из ключевых патологических особенностей общих среди нескольких нейродегенеративных заболеваний является формирование аномальных белковых агрегатов, что происходит в белок / болезни определенным образом 1. Таким образом, есть характерные extraneuronal бета-амилоида бляшки и агрегированные гиперфосфорилированного депозиты тау внутри нейронов при болезни Альцгеймера (AD); агрегированные альфа-син депозиты в тельцами Леви (LB), которые внутринейрональную включений, а также в пределах дистрофических процессов нейронов, называемых Lewy невриты (LNS) в ПД, ПД деменции и деменции с тельцами Леви (DLBs) 2-4. Аномальные альфа-син месторождения также видели в знаковых поражений глиальных цитоплазматических включений в MSA 5. При болезни Гентингтона, есть характерные Поли-Q отложения, и обязательным ненормальным Тар ДНК белок-43 и сплавляют в саркомы белков (FUS) откладываются в лобно-височных деменций. Важно для PD, генные мутации α-син, как было установлено КауSE аутосомно-доминантное ПД 6-11. Кроме того, α-син гена утроение 12 и дублирование 13 также вызывает семейной PD, таким образом, связывая повышенную экспрессию α-син в pathomechanisms БП. Примечательно, как спорадические случаи и семейные PD гавань аномальные вклады α-син патологии 14. Текущие доступные методы лечения PD только паллиативная и не имеют никакого влияния на прекращение или замедление прогрессирования заболевания неумолимый.

α-син в большом количестве экспрессируется в мозге человека, и составляет около 1% от общего белка мозга. Он присутствует более конкретно в нейронах, но может существовать в более низких хотя количествах в глиальных клетках. Спорным моментом является нативной структуры альфа-син, который может существовать в виде случайного мономера 15 или сложенном тетрамера 16. Во время болезни, α-син меняет свою конформацию, что позволяет ему получить неправильно упакованных и этот процесс считается причиной болезни pathogeНесис. Несмотря на несколько лет исследований в патофизиологических аспектов альфа-син и болезни, точные причины заболевания еще механизмы остаются неясными 14.

Исследования с использованием посмертный анализ мозга Паркинсона до сих пор при условии, важные подсказки относительно нормальной и аномальной биологии α-син и в спорадических PD, а также PD связаны с мутациями в гене LRRK2 17-22. Здесь биохимический протокола экстракции (см схеме, представленной на рисунке 1) для более нерастворимых альфа-син депозитов человека посмертного PD мозговой ткани, которые укрывают α-син агрегатов в разной степени было описано. Эта методика также может быть приспособлена с изменениями в буферных композиций для изучения агрегатные белки из других нейродегенеративных заболеваний 23,24, а также от трансгенного животного мозговой ткани 25-27. Основное внимание на адаптации являются различия в solubiмируемости и общая сумма соответствующих белков, некоторые из которых, главным образом, ядерные и, возможно, потребуется высокой соли буферы для оптимальной экстракции, как показано на FUS 28.

Protocol

Посмертное ткани мозга были подарены королеве площади Brain Банка неврологических расстройств, Университетский колледж Лондона, Институт неврологии, используя этически утвержденные протоколы и хранятся для исследования основании лицензии, выданной органом человеческого тканей (ОМТ) Великобритания (нет. 12198). См перечень случаев, используемых для этого протокола (таблица 1). 1. Подготовка буферов Подготовка 1X TBS (трис-буферный солевой раствор) буфер: Подготовка 10X TBS, как исходного раствора с 500 мМ Трис-HCl рН 7,4 и 1,500 мМ NaCl. Взвесить 60,5 г Трис-Cl рН 7,6 и 87,6 г NaCl в 800 мл воды высокой степени чистоты. Регулировка рН с помощью 1 М HCl и конечного объема запасов к 1 л Подготовка конечной концентрации 1X TBS путем разбавления фондовом в 10 раз дистиллированной водой. Добавить ингибиторы протеазы (ИП), (1 таблетка на 50 мл буфера) и Фос-стоп таблетки ингибитор фосфатазы (1 таблетка на 10 мл буфера) вотменить действие неспецифических ферментативных действий протеаз и фосфатаз. Примечание: Здесь мы использовали ингибитор фермента таблетки от Roche, но в равной степени других коммерчески доступных ингибиторов может быть использован в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Подготовьте TBS-буфера SDS добавлением 5% вес / объем натрия додецилсульфат (SDS) в 1X TBS (рН 7,4) буфера. Раствор нагревают до 60 ° С при постоянном перемешивании с использованием магнитной мешалки, чтобы растворить SDS. Подготовьте TBS-ДСН-буфера мочевины путем добавления мочевины до конечной концентрации 8 м / о, чтобы 1X TBS-буфера SDS (рН 7,4). Раствор нагревают до 60 ° С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке, чтобы растворить мочевину. 2. Образец Гомогенизация и дифференциальные Ультрацентрифугирование Примечание: следующая часть работы включает в себя обработку человека ткани головного мозга в соответствии с правилами HTA Великобритании. Местные стандартные операционные процедуры следуют на всех Tiмес. Образцы мозга расчленены из замороженных блоков мозга и тканей гомогенизировали материала в microcabinet поддерживается при отрицательном давлении. Одноразовые халаты, перчатки, маски для лица-Над-обуви протекторы и защитные очки носят в течение всей процедуры. Отходы человеческого тканевого отбрасывается после автоклавирования при 121 ° С в течение 20 мин для безопасной утилизации. Острые (скальпель лезвия) расположены в соответствующем контейнер для острых предметов для локализации и безопасной утилизации. Возьмите кусок замороженного человеческого ткани (примерно 0,5 г в весе от базальных ганглиев области) и быстро пропустить через мясорубку на небольшие фрагменты (примерно 1 мм 2) на льду с использованием небольшой чашке Петри и стерильный скальпель лезвием. Использование отдельного чашки Петри и скальпель лезвие для каждого образца. Сбор измельченной ткани в 15 мл пробирку и добавляют 10 объемов ледяной 1XTBS буфера в пробирку. Однородный образцы с использованием механического гомогенизатора при 20000 оборотах в минуту в течение 10 сек. Охлаждают на льду в течение 2 мин. Повторите этот шаг три разас. Примечание: Это делается для того, что образцы не нагреваются в то время как гомогенизации. Уточнить путем центрифугирования при 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Отменить шарик негомогенизированном материала. Возьмите супернатант (сырой гомогената), добавить в поликарбонатные центрифужные пробирки (размер трубы зависит от размера ротора) и баланс тщательно. Центрифуга при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С. Сохраните супернатант, как это ТБС-растворимой фракции. Промыть гранул дважды в пяти объемах буфера 1X TBS и центрифуги каждый раз при 100000 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Откажитесь от супернатантов. Ресуспендируют Конечный осадок обработкой ультразвуком осадок в течение 10 сек при 20 кГц приблизительно 5 объемов 1X TBS-SDS при комнатной температуре. Примечание: перед добавлением SDS содержащих образцов буфера должен быть доведен при 10 ° С, чтобы избежать SDS осадков. Ультрацентрифуга при 100000 х г в течение 30 мин при 25 ° С. Сохранение супернатант, как это йе SDS растворимой фракции. Промыть осаждения два раза в 5 объемах 1X TBS-буфера SDS при комнатной температуре. Центрифуга каждый раз при 100000 х г в течение 15 мин при 25 ° С. Солюбилизации конечный осадок в 50 мкл 1X TBS-SDS-мочевину буфером с помощью ультразвукового установленный на 20 кГц в течение 10 секунд, чтобы достичь полного растворения; это называется растворимой фракции мочевины. Анализе каждой фракции на общее содержание белка с использованием коммерческого набора для анализа белка в соответствии с протоколом производителя. Развести образцы TBS-ДСН-мочевины 1: 1 с буфером TBS 1X, чтобы позволить совместимость с белковым анализом реагентов. Образцы замерзнуть в небольших аликвот (20 мкл) при -80 ° С, чтобы уменьшить циклов замораживания-оттаивания. Примечание: Добавление 10% глицерина в образцах рекомендуется для длительного хранения при -80 ° С. 3. Иммуноблоттинг образцов и анализа результатов Запуск образцы из TBS, TBS-SDS и TBS-SDS-мочевины экстрактов на 10-скважины 4-12% Бис-Трис полиакриламид гельс MOPS буфера, как работает с использованием стандартных методик. См Галлахер и Чакраварти (2008) 29 для детального протокола вестерн-блот. Нагрузка 10 мкг белка из каждого образца на каждой дорожке вместе с маркер молекулярной массы для TBS и SDS и фракций мочевины. Запуск гель при 200 V в течение 1 часа или до синего красителя из загрузочного буфера достигает дна геля. Передача белки из гелей электрофореза на нейлоновые мембраны 28, предварительно смоченных сначала в 100% метаноле, а затем в передаче буфера, содержащего 20% метанола. Обеспечение опознавательный знак на блот, чтобы определить сторону белка и ориентацию маркеров размера молекулярной массы. Сэндвич гель с мембраной вместе влажной фильтровальной бумагой. Правильное расположение мембраны имеет решающее значение с мембраной между гелем и анодом. Выполнение передачи в течение 2 ч при 40 В. Макияж 1X PBS-Tween (1X PBS-T) буфер: растворить 1 таблетку PBS в 200 млводы с получением 0,01 М фосфатном буфере, 0,0027 М хлорида калия и хлорида 0,137 М натрий, рН 7,4. Блок мембраны в 5% -ном растворе БСА в 1X PBS-T в течение 30 мин при встряхивании при 70 оборотах в минуту. Это предотвращает неспецифического связывания первичного антитела к мембране. Зонд белка блот 6 мл альфа-син первичное антитело Syn-1 (BD Biosciences; моноклональное антитело мыши) в соотношении 1: 750 разбавление (O / N при 4 ° С) с последующим серии промывок 1X PBS-T ( 3 х 5 мин каждый раз) 28. Инкубируйте блот с соответствующим HRP, конъюгированное вторичное антитело в масштабе 1: 2000 разбавление в течение 30 мин. Выполните серию промываний (3 х 5 мин каждый раз) с 1X PBS-T. Погружают блотов в расширенной раствора хемилюминесценции на 15 сек в темной комнате. Обложка пятна с пленкой и место Авторадиография фильмов против Промокните стороны белка в светонепроницаемый кассеты, чтобы захватить соответствующие сигналы (подходящих полос размер). Разработка Авторадиография фильмы в автоматическом разработчика. Примечание: Пятна также могут быть разработаны вручную с помощью проявитель и фиксаж из коммерческого источника в случае автоматизированная машина разработчик не доступны. Инкубируйте Вестерн-блоттинг с 6 мл вестерн-блоттинга зачистки буфера в течение 10 мин с постоянном встряхивании лишить блот антитела сигнала альфа-син. Выполните шаги 3,43 через, чтобы, используя 3.6.2 бета-актина первичного антитела (мышиное моноклональное) в 1: 8000 разбавления. Сканирование и преобразовывать окончательное изображение в изображение и измерить плотность Tiff с использованием NIH ImageJ для целей количественного (бесплатно загружаемое программное обеспечение). Примечание: Программное обеспечение позволяет читать плотностей относительной площади интереса (соответствующие полосы размер), и данные могут быть выражены либо в соотношении α-син плотности / бета-актина (ген дом по поддержанию) в качестве условных единиц или на свои собственные, когда ген дом хранение не действует (как в случае мочевины растворимых пробах). </li>

Representative Results

TBS, SDS и мочевины растворимых белков, извлеченные из базальных ганглиев в соответствии с протоколом, показанного на фиг.1 проводили на геле и иммуноблоттинг с син-1 мышиного моноклонального альфа-син первичным антителом. ТБ растворимые фракции отображается наличие мономерного альфа-син (~ 14 кДа видов) в ПД и контроля дел, рассмотренных (рис 2А). В SDS растворимые фракции также показал обильные мономерного альфа-син во всех трех подтипов изученных случаях, как показано в нижней блот экспозиции (рис 2С). Случаи PD также показали более высокую молекулярную массу (ММ) альфа-син видов, как видно на высоком блот экспозиции, которые, вероятно, будут олигомеры (рис 2С). Мочевины, растворимые фракции из БП случаях показали повышенные количества альфа-син мономеров, олигомеров и агрегированных видов по сравнению с контрольными дел. В неокортекса идиопатические случаи PD демонстрируют более высокие объемы AGGREG ованные α-син видов, в то время как лимбической случаи показывают промежуточные уровни нерастворимого альфа-син. Оба SDS и мочевины из фракции идиопатических случаев ПД продемонстрировать различные уровни усеченных альфа-син продукции на 12 кДа и 6 кДа, как описано 20. В противоположность этому, случаи управления не показали нерастворимый или агрегированных альфа-син (рис 2E). Полу-количественные показатели плотности отражают количество LB нагрузки как categoriesd помощью α-син иммуногистохимии, демонстрирующий нерастворимый характер агрегированной а-син (рис 2B, 2D, 2F) в неокортекса и лимбической случаях ПД. Рисунок 1. Принципиальная схема нерастворимого альфа порядке -syn экстракции.rget = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Типичные иммуноблоты альфа -syn уровнях от PD и контролировать человеческую ткань. TBS, SDS и мочевины растворимые фракции от базальных ганглиев (региона, который таит в α-син патологии в ЧР случаев) идиопатических случаев ПД и неврологических нормально (контроля) Мозги были проанализированы на наличие альфа-син, используя западную иммуноблот. 10 мкг белка наносили на каждую дорожку. В TBS фракции (А), в основном α-син мономеры присутствуют во всех случаях. В SDS фракции (C), некоторые олигомеры альфа-син видны вместе с мономерами преимущественно в PD ткани. В фракций мочевины (С), мономеров, олигомеров и агрегированной а-син переменно выражается в PD случаев рефлектиновг их соответствующие нагрузки LB. В неврологической нормальные контрольные образцы показывают наличие только небольших количеств мономера альфа-син. Пожалуйста, обратите внимание возможные продукты деградации альфа-син которые видны в некоторых случаев с высокой нагрузкой LB. Сплошная глава стрелка представляет мономерной формы альфа-син. Символ * возможно представляет собой C-терминально укороченная форма альфа-син, как описано ранее 20,26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. случай Секс Возраст на момент смерти YRS задержка посмертное (ч) рН ткани Неокортекса 1 М 82 40 6.3 Неокортекса 2 F 75 35,3 6.4 Лимбическая 1 М 81 28,5 6.2 Лимбическая 2 F 79 36,5 6.2 Контроль 1 М 80 38 6.1 Контроль 2 F 83 32,5 6.3 Таблица 1. Ограниченные демография случаев используются

Discussion

Эта статья описывает биохимический протокол для извлечения и экспертизы дифференциальных свойств растворимости мономерной, олигомерной и агрегатируется альфа-син из больных мозгов, используя денатурирующих гель работу. Это хорошо создана методика исследования агрегированный α-син 17, 18, ​​20, 21 белок, который, как правило, растворимы в своей родной форме, но получить амилоидогенных или повышенные свойства агрегации с прогрессированием заболевания или с генетическими мутациями. Тем не менее, некоторые группы используют небольшие изменения в концентрациях SDS в их буферах (8% или 10% вместо 5%) 21,22, 30. ПБС анионный детергент и solubilises альфа-син олигомеров, которые могут включать мембраной формы α-син, в то время как мочевина, хаотропный реагент денатурирует нерастворимые агрегированные и фибриллярные или амилоидогенных формы альфа-син 20. В связи с этим систематическое исследование Paleologou др 31 исследовали стабильностьальфа-син олигомеров и фибрилл с различными концентрациями мочевины (6,5 – 8 м) или SDS (0,25-2%) и сообщили, что олигомеры стабильные концентрации SDS, но не с высокой концентрацией мочевины. Их ФИЛА-1 антитела, специфичные для альфа-син олигомеров и фибрилл обнаружены высокие концентрации фибрилл в 6,5 М концентрации мочевины под неденатурирующих условиях. Концентрации буфера, используемого в этом протоколе близко отражает то, что было описано в Culvenor др. (1999) 32.

Анатомические области мозга для биохимического извлечения нерастворимого альфа-син должны быть тщательно отобраны, и это должны отражать альфа-син LB и LN нагрузку в зависимости от прогрессирования заболевания 33,34. Случаи, используемые здесь, базальные ганглии образцы из неокортекса и лимбической подтипов PD отражающих поздно, и промежуточные этапы PD прогрессии в соответствии с McKeith ctriteria 34. В Queen Square мозга банка, одна половина мозгарегулярно фиксировали в формалине для гистохимических анализа, а другая половина тщательно расчлененный в различных анатомических областей и флэш-замораживали и хранили при -80 ° С морозильников для дальнейших биохимических и ДНК исследований / анализа РНК. После фиксации формалином мозгов и рассечения невропатологи, иммуногистохимии осуществляется с помощью α-син антитела и результаты архив. Кроме того, как с помощью обычных методик, рН ткани мозга измеряется по прибытии в качестве меры агональном состояния мозговой ткани. Это формирует прочную основу для качества сохранности ткани для биохимического анализа.

Наши данные показывают, что здесь есть более SDS растворяется α-син мономера в ЧР случаях по сравнению с контроля; в частности неокортекса случаи PD имеет более высокую нагрузку α-син по сравнению с различными лимбической PD. В неокортекса случаи представляют большую прогрессирование БП α-син патологии в неокортекса регионах, таких как лобной и теменной Коррешеткам 33,34. Лимбической случаи PD имеют более высокие баллы LB в базальных отделах переднего мозга / лимбической области таких областях, как миндалевидное тело, transentorhinal и поясной областей. Для содержательного данных и статистического анализа, нужно бежать по меньшей мере 4 случая из каждой группы. Точно так же мы не пытались статистический анализ данных, представленных здесь блот.

Он также должен отметить, что различные антитела могут распознавать различные формы / состав высшего порядка альфа-син олигомеров, и каждый может иметь свое собственное относительную чувствительность и предпочтения. Это видно из результатов Тонг и др. 29, где они показывают, что 4 различных альфа-син антитела (син-1, СС, онко и LB509) дают сменные результаты, по крайней мере для альфа-син олигомеров / агрегатов. Мономеры α-син были признаны аналогичными степени всеми 4 антител, хотя они могут иметь вариации в зависимости от того, находится ли антитело эпитоп α-син либо в N-терминал или Cтерминальном 29. Точно так же, специфические антитела для фосфо-синуклеина определить четкую высокого молекулярного веса α-синуклеиновых видов 20,21. В методике, описанной здесь, высоко характеризуется антитела Syn-1 был использован 19-21.

Тем не менее, важно учитывать проверки какие-либо новые антитела на Вестерн-блоттинга с помощью антител экспериментов предварительной абсорбции, а также сверхэкспрессии и нокдаун белка в клетках.

Это важно учитывать и другие варианты, которые были применены исследователями для определения небольших фрагментов альфа-син и нестабильные или тетрамерные альфа-син форм. Это может включать легкой фиксации мембраны с 0,4% PFA в PBS, чтобы сохранить усеченные формы альфа-син 35 или лечения образца гомогената с сшиватели для стабилизации тетрамеров 36.

Точная биохимическая оценка белков с использованием посмертный тиСГУП требует минимизации деградации белка ферментативный и модификации. Поэтому целесообразно использовать ткань с кратчайшие задержки посмертных и / или выберите подобранные образцы в случае когорт. Иммуногистохимия с использованием стандартных антител для α-син иммуногистохимии должны быть выполнены до начала протокола изоляции. Степень α-син патологии сильно варьирует и может меняться в зависимости от областей, выбранных. Желательно, чтобы выбрать участки с обильной патологии в качестве положительного контроля для оптимального выхода с каждого запуска. Применение ингибиторов протеазы и, если необходимо, ингибиторы фосфатазы для предотвращения нежелательного ферментативного расщепления после освобождения внутриклеточных протеаз или фосфатаз, возникающих в процессе лизиса клеток и поддержание пробы при 4 ° С имеет решающее значение.

Важно, что все образцы в пределах партии экспериментов обработаны равномерно и стабильно, чтобы избежать изменений внутри пользовательских; несколько FREСледует избегать циклов Эз-оттаивания, так как это может потенциально отказаться пост-трансляционные модификации, такие как фосфорилирование. Критическая точка иметь в виду при рассмотрении большого числа образцов, что данные иммуноблоттинга должны быть нормализованы к одному образцу, который должен работать параллельно с другими образцами всех на гелях и все данные, которые ссылаются на этот образец. Это делается для того, нормализация данных иммуноблота между несколькими пятнами. Этот метод принят в нашей недавнем исследовании 22.

Следует отметить, что для того, чтобы сохранить фоновое ECL низким блоты не следует высыхать в любой момент во время протокола вестерн-блот. Кроме того, очень длинных выдержках (> 10 мин) на Авторадиография фильмов следует избегать, поскольку это приведет к насыщению сигнала ECL и приведет к неточному количественного определения.

Это выше протокол является относительно простым техника с использованием общих лабораторных реагентов и вструментов и может быть ценным инструментом для исследования патофизиологии α-син белка в PD исследований. Эта методика не может быть продлен только с соответствующими изменениями к изучению α-син биологии в альфа-син трансгенных животных, но и для других нейродегенеративных заболеваний, показывающих аномальные вклады агрегированных белков, таких как AD, MSA, DLB, HD и frontotemporaldementias. Однако данные Вестерн-блоттинга, описанные здесь, могут также быть подтверждено с помощью иммуноферментного анализа с использованием антитела к конкретным формам альфа-син 31.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

I thank Dr Adamantios Mamais for extracting α-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson’s Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.

Materials

Tris-HCL Sigma T5912
sodium chloride VWR 27800.291
SDS Fluka 71727
Urea Sigma U5378
Protease inhibitor tablets  Roche 04 693 116001
Phosphatase inhibitor tablets  Roche  04 906 837001
Phosphate buffered saline tablets  Sigma  P4417
Tween-20  Sigma P9416
NuPAGE MOPS SDS running buffer Invitrogen NP0001
NuPAGE transfer buffer Invitrogen NP0006-1
Hybond-P membrane  GE Healthcare RPN303F
Whatman 3MM filter paper Sigma WHA30306185
Bis-tris gels 4-12%  Invitrogen  NP0322BOX
Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate Pierce 34080
Bio-RAD DC protein assay kit  Bio-Rad 500-0112
Thickwall Beckman Polycarbonate tubes Beckman 355630
Western blot stripping buffer Thermo scientific 46430
Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) BD Biosciences 610786
beta-actin primary antibody (mouse monoclonal  Sigma A5441
HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody Santa Cruz sc-2031
Bovine serum albumin Sigma A7030
Instrument Company Rotor/ model no 
Benchtop Ultracentrifuge Optima Max Beckman MLA-80
Sonicator Heat Systems XL20-20
Homogeniser Jenke and Kunkel TP18/10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).
  2. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, . M. A-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
  3. Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).
  4. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).
  5. Ahmed, Z., et al. The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy. Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).
  6. Ploymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276, 2045-2047 (1997).
  7. Kruger, R., et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson’s disease. Nat Genet. 18, 106-108 (1998).
  8. Zarranz, J. J., et al. The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia. Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).
  9. Proukakis, C., et al. A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease. Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).
  10. Kiely, A., et al. Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson’s disease and Multiple System atrophy?. Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).
  11. Lesage, S., et al. G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome. Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).
  12. Singleton, A. B., et al. Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302, 841 (2003).
  13. Chartier-Harlin, M. C., et al. Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364, 1167-1169 (2004).
  14. Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A. Genetic neuropathology of PD. Int J Clin Exp Pathol. 1 (3), 217-231 (2008).
  15. Fauvet, B., et al. α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer. J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).
  16. Bartels, T., et al. α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477, 107-110 (2011).
  17. Campbell, B. C., et al. Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies. Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).
  18. Campbell, B. C., et al. The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson’s disease. J Neurochem. 76, 87-96 (2001).
  19. Miller, D. W., et al. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson’s disease with SNCA locus triplication. Neurology. 62, 1835-1838 (2004).
  20. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  21. Zhou, J., et al. Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).
  22. Mamais, A., et al. Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson’s disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases. Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).
  23. Lashley, T., et al. A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies. Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).
  24. Brelstaff, J., et al. Transportin-1: a marker of FTLD-FUS. Acta Neuropathol. 122 (5), 591-600 (2011).
  25. Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).
  26. Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136, 412-432 (2013).
  27. Tofaris, G. K., et al. Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders. J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).
  28. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  29. Gallagher, S., Chakravarti, D. Immunoblot analysis . J Vis. Exp. (16), e759 (2008).
  30. Tong, J., et al. Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson’s disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation. Brain. 133, 172-188 (2010).
  31. Paleologou, K. E., et al. Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies. Brain. 132, 1093-1101 (2009).
  32. Culvenor, J. G., et al. Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited. American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).
  33. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).
  34. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
  35. Lee, B. R., Kamitani, T. Improved immunodetection of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 6, e23939 (2011).
  36. Newman, A. J., et al. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 8 (11), e81314 (2013).

Tags

Alpha-synucleinParkinson’s DiseaseSequential ExtractionSolubleInsolubleBasal GangliaHomogenizationUltracentrifugationTBSSDSUrea

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bandopadhyay, R. Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains. J. Vis. Exp. (107), e53415, doi:10.3791/53415 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image