For å definere en viss neuronal (mikro) krets, må man begynne med å finne de forskjellige deltagerne i nevnte krets, og deres forbindelse mønster. Helt siden Waller publikasjon om neurofiber sporing gjennom lesioning ^en et stort utvalg av nevroanatomi følgeteknikk er etablert. Noen av disse teknikkene kan anvendes i fast vev post mortem ^2-4, andre er avhengige av den aktive transport av fargestoffet i levende neuroner, som ble oppdaget i 1971 ^5-6. Det sistnevnte kan videre deles i to grupper diskriminere mellom fremgangsmåter som benytter seg av aktiv retrograd (fra det injiserte område til kilden for et gitt fremspring, dvs. Den somata av nevroner som projiserer til nevnte område) og aktiv antero (fra det injiserte område til målet på en gitt projeksjon, altså. de aksonale projeksjoner og aksonale terminalene på merket nevroner) transport. Også, i noen tilfeller tracer materiale injiseres i levende dyr som deretter overlever injeksjonen av flere dager eller uker (in vivo spor injeksjoner), mens i andre tilfeller eksplanterte hjerner er injisert, og inkuberes i flere timer etter injeksjonen i kunstig cerebrospinalvæske (in vitro tracer injeksjoner) .

I denne protokollen endret vi en eksisterende in vitro electroporation teknikken ^7-8 å merke nevronale somata og prosesser i anterograd og retrograd Tracing eksperimenter med choleratoxin subenhet-b og tetramethylrhodamine dekstran som tracing stoffer. Det overordnede målet med denne protokollen er å gi nevrologer med et effektivt verktøy for å spore nevronale tilkoblingsmønsteret mellom ulike hjernekjerner, og samtidig utnytte tilgjengelige transgene mus linjer og grunnleggende optisk utstyr for å øke målretting nøyaktighet under tracer injeksjoner. Selv om metoden for antero og retrograd sporing ved hjelpcholeratoxin og dekstran amin og deres respektive fluorescerende merkede konjugater er ikke ny ^9-13 (som er den metode for elektroporering, f.eks. Haas et al. ^14), kombinasjonen av tracer injeksjoner med elektroporering i en in vitro-preparatet omfatter blokker av hjernevev er en nyere utvikling ^7. Dens viktigste fordel i forhold til neuronal følgeteknikk ved bruk av samme type tracer fargestoffer i levende dyr er den økte merking intensitet, på grunn av den høyere effektivitet med hvilken elektroporert fargestoffet blir tatt opp av nerveceller. En ytterligere fordel er den forkortede inkubasjonsperioden (nødvendig for fargestoffet transport) og dens target øket nøyaktighet i løpet av sporstoffinjeksjons, fordi experimenter har visuell kontroll over målområdet av injeksjonen. Det sistnevnte betyr også at ingen dyre stereoutstyr er nødvendig for å finne kjernen eller hjerneområde av interesse.

Til Addinalt øke målretting nøyaktighet, vi tok fordel av en transgen mus linje, som uttrykker GFP i sin glycinergic undergruppe av nevroner ^{15 og} grunnleggende optisk utstyr som består av en håndholdt laserpeker over 405 nm bølgelengde og matchende band-pass filtrering briller (450 – 700 nm). Således oppnådde vi en betydelig ytterligere økning av målretting nøyaktighet ved å identifisere injeksjonsstedet gjennom sin fluorescerende signal, og ved å tilveiebringe en bedre måte å kontrollere for fargestoffet spredning innenfor injeksjonsstedet gjennom observasjon av interaksjonen mellom egne GFP signalet og tracer fluorescens. Vår teknikk gjør det også mulig å avdekke funksjonaliteten til en krets sammen med sin tilkobling ved å identifisere GFP-positive hemmende nerveceller (eller eksitatoriske i andre mus linjer) som ble fylt med tracer.

I sammendraget, vi ytterligere forsterket et kraftig nevrovitenskapelig verktøy for å studere connectome av virveldyr hjernen og vurdere tHan ulike nevroanatomi funksjoner i en gitt neurocircuit. Ved å bruke transgene mus sammen med billig og allment tilgjengelig optisk utstyr var vi i stand til å betydelig øke målretting nøyaktigheten av våre injeksjoner. Videre transgene mus tillatt oss å identifisere hvilken type de spores tilkoblinger, som bidro til å avdekke funksjonaliteten til en hemmende mikrokrets i den auditive hjernestammen.