Afin de définir un certain neuronale (micro) circuit, il faut commencer par trouver les différents acteurs de ce circuit, et leur mode de connexion. Depuis la publication de Waller propos neurofiber traçage travers lesioning ¹ une grande variété de techniques de traçage neuroanatomiques a été établi. Certaines de ces techniques peuvent être appliquées dans les tissus post-mortem ^2-4 fixe, d'autres comptent sur ​​le transport actif du colorant dans les neurones vivants, comme l'a découvert en 1971 ^5-6. Celui-ci peuvent être subdivisés en deux groupes de discrimination entre les méthodes qui prennent avantage de rétrograde active (à partir de la zone injectée à la source d'une projection donnée, ie. Le soma des neurones qui sont saillie vers ladite zone) et antérograde active (de la injecté zone à la cible d'une projection donnée, ie. les projections axonales et les terminaisons axonales des neurones marqués) transport. En outre, dans certains cas, tramatériel de CER est injecté dans les animaux vivants qui a ensuite survivent à l'injection de plusieurs jours ou semaines (en injections de traceurs in vivo), tandis que dans d'autres cas cerveaux explantées sont injectés et incuber pendant plusieurs heures après l'injection dans le liquide céphalo-rachidien artificiel (in vitro injections de traceurs) .

Dans ce protocole, nous avons modifié un existant in vitro technique d'électroporation ^7-8 à étiqueter soma et les processus neuronale dans antérograde et rétrograde traçage des expériences utilisant dextran choleratoxine la sous-unité B et tétraméthylrhodamine que les substances de traçage. L'objectif global de ce protocole est de fournir des neuroscientifiques un outil efficace de suivre les modèles de connectivité neuronale entre les différents noyaux du cerveau, tout en profitant des lignées de souris transgéniques et des équipements disponibles optique de base afin d'augmenter la précision de ciblage lors des injections de traceurs. Bien que la méthode de traçage antérograde et rétrograde en utilisanttoxine cholérique et amine dextrane et leurs conjugués marqués par fluorescence respectifs sont pas nouvelles ^9-13 (ce qui est la méthode de l'électroporation, par exemple. Haas et al. ^14), la combinaison d'injections traçantes avec une électroporation dans une préparation in vitro impliquant des blocs de tissu de cerveau est un développement plus récent ^7. Son principal avantage par rapport aux techniques de traçage de neurones en utilisant le même type de colorants traceurs dans les animaux vivants est l'intensité de marquage accru, en raison de la plus grande efficacité avec laquelle le colorant est une électroporation repris par les neurones. Un avantage supplémentaire est la période d'incubation de raccourci (obligatoire pour le transport de colorant) et de sa précision accrue cible lors de l'injection du traceur, parce que l'expérimentateur a le contrôle visuel sur la zone cible de l'injection. Ce dernier signifie aussi qu'aucun équipement stéréotaxique coûteux est nécessaire de trouver le noyau ou le cerveau zone d'intérêt.

Pour Addilement augmenter la précision du ciblage, nous avons profité d'une lignée de souris transgénique qui exprime la GFP dans son sous-population glycinergique de neurones ¹⁵ et l'équipement optique de base consistant en un pointeur de 405 nm lunettes de filtrage passe-bande de longueur d'onde et l'appariement laser à main (450 – 700 nm). Ainsi, nous avons réalisé une nouvelle augmentation significative dans le ciblage de précision en identifiant la zone d'injection au travers de son signal fluorescent et en fournissant un moyen plus fin pour contrôler la propagation du colorant dans la zone d'injection à travers l'observation de l'interaction entre le signal de la GFP indigène et le traceur fluorescence. Notre technique permet également de découvrir la fonctionnalité d'un circuit en même temps que sa connectivité en identifiant les neurones inhibiteurs GFP-positives (ou d'autres excitateurs dans des lignées de souris) qui ont été remplis avec le traceur.

En résumé, nous avons amélioré un outil puissant pour étudier neuroscientifique le connectome du cerveau des vertébrés et évaluer til différentes fonctions neuro-anatomiques d'un neurocircuit donné. En utilisant des souris transgéniques avec l'équipement optique peu coûteux et largement disponible, nous avons réussi à augmenter significativement la précision de ciblage de nos injections. En outre, les souris transgéniques nous a permis d'identifier le type de connexions tracées, ce qui a permis la découverte de la fonctionnalité d'un microcircuit inhibitrice dans le tronc cérébral.