Per definire un certo (micro) circuito neuronale, si deve avviare da trovare vari partecipanti di detto circuito, e il loro modello di connessione. Da quando la pubblicazione di Waller su neurofiber rintracciare attraverso la lesione ¹ una grande varietà di tecniche di tracciamento neuroanatomiche è stata stabilita. Alcune di queste tecniche possono essere applicate in tessuto fissato post mortem ^2-4, altri si basano sul trasporto attivo del colorante nei neuroni vivi, come scoperto nel 1971 ^5-6. Quest'ultimo può essere ulteriormente suddiviso in due gruppi discriminano tra metodi sfruttando retrograda attiva (dalla zona iniettata alla sorgente di sporgenze, cioè. Somata di neuroni che sono sporgenti da detta area) e anterograda attiva (dal iniettato zona al target di una data di proiezione, cioè. le proiezioni assonale ei terminali assonale dei neuroni marcati) di trasporto. Inoltre, in alcuni casi di tramateriale cer viene iniettato in animali vivi che poi sopravvivono l'iniezione di diversi giorni o settimane (a iniezioni vivo tracciante), mentre in altri casi cervelli espiantati vengono iniettati e incubare per diverse ore dopo l'iniezione di liquido cerebrospinale artificiale (in vitro iniezioni tracciante) .

In questo protocollo abbiamo modificato uno esistente in vitro tecnica elettroporazione ^7-8 per etichettare somata e processi neuronale nel anterograda e tracciamento retrogrado esperimenti usando choleratoxin subunità-b e tetramethylrhodamine destrano le sostanze tracciamento. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire neuroscienziati con uno strumento efficiente per tracciare modelli di connettività tra i diversi nuclei neuronali del cervello, usufruendo di linee disponibili topo transgenico ed apparecchiature ottiche di base al fine di aumentare la precisione di mira durante le iniezioni traccianti. Sebbene il metodo di anterograda e retrograda usando tracingcholeratoxin e ammina destrano e rispettivi coniugati fluorescente non è nuova ^9-13 (come è il metodo di elettroporazione, per es. Haas et al. ^14), la combinazione di iniezioni traccianti con elettroporazione in una preparazione in vitro coinvolgono blocchi di tessuto cerebrale è uno sviluppo più recente ^7. Il principale vantaggio rispetto alle tecniche di tracciatura neuronali utilizzando lo stesso tipo di coloranti traccianti di animali vivi è la maggiore intensità di etichettatura, a causa della maggiore efficienza con cui il colorante elettroporate viene ripreso dai neuroni. Un ulteriore vantaggio è il termine abbreviato di incubazione (necessario per il trasporto di colorante) e la sua maggiore accuratezza bersaglio durante l'iniezione tracciante, perché lo sperimentatore ha il controllo visivo sull'area bersaglio di iniezione. Quest'ultimo significa anche che non costose apparecchiature stereotassica è richiesto per trovare il nucleo o il cervello area di interesse.

Per addizionale aumentare la precisione di mira, abbiamo approfittato di una linea di topi transgenici, che esprime GFP nella sottopopolazione glicinergica di neuroni ¹⁵ ed apparecchiature ottiche di base che consistono di un puntatore laser portatile di 405 nm occhiali passa-banda di lunghezze d'onda e la congruenza di filtraggio (450 – 700 nm). Così, abbiamo ottenuto un ulteriore significativo aumento di targeting accuratezza individuando la zona di iniezione attraverso il suo segnale fluorescente e fornendo un modo più fine di controllare per la diffusione di colorante all'interno dell'area di iniezione attraverso l'osservazione dell'interazione tra il segnale GFP indigena e il tracciante fluorescenza. La nostra tecnica permette anche di scoprire la funzionalità di un circuito con la sua connettività identificando neuroni inibitori GFP-positive (o eccitatorio in altre linee di topo), che sono stati riempiti con il tracciante.

In sintesi, abbiamo ulteriormente migliorato un potente strumento per studiare la neuroscientifica connettoma del cervello dei vertebrati e valutare tha diverse caratteristiche neuroanatomiche di un determinato neurocircuit. Utilizzando topi transgenici con apparecchiature ottiche economico e largamente disponibile siamo stati in grado di aumentare significativamente la precisione di mira dei nostri iniezioni. Inoltre, i topi transgenici ha permesso di identificare il tipo di connessioni tracciate, che hanno contribuito scoprire la funzionalità di un microcircuito inibitorio nel tronco cerebrale uditivo.