For at fastlægge en vis neuronal (mikro) kredsløb, må man starte med at finde de forskellige deltagere af nævnte kredsløb, og deres forbindelse mønster. Lige siden er blevet etableret Waller publikation om neurofiber opsporing gennem læsionsdannelsen ¹ et stort udvalg af neuroanatomiske tracing teknikker. Nogle af disse teknikker kan anvendes i fikseret væv post mortem ^2-4, andre er afhængige af den aktive transport af farvestoffet i levende neuroner, som opdagede i 1971 ^5-6. Sidstnævnte kan yderligere opdeles i to grupper, diskriminerer mellem metoder udnytter aktiv retrograd (fra det injicerede område til kilden til en given projektion, dvs.. Den somata af neuroner, der rager til nævnte område) og aktiv anterograd (fra den injicerede område til målet om en given projektion, dvs.. de axonale fremskrivninger og axonale terminaler mærkede neuroner) transport. Også i nogle tilfælde tracer materiale indsprøjtes i levende dyr, som derefter overlever injektionen af flere dage eller uger (in vivo tracer injektioner), mens der i andre tilfælde eksplanterede hjerner injiceres og inkuberes i flere timer efter injektionen i kunstig cerebrospinalvæske (in vitro tracer injektioner) .

I denne protokol ændrede vi en eksisterende in vitro elektroporation teknik ^7-8 til at mærke neuronal somata og processer i anterograd og retrograd tracing forsøg med choleratoxin subunit-b og tetramethylrhodamin dextran som sporing stoffer. Det overordnede mål med denne protokol er at give neuroforskere med et effektivt redskab til at spore neuronale tilslutningsmuligheder mønstre mellem forskellige hjerneområder kerner, samtidig udnytte tilgængelige transgene mus linjer og grundlæggende optisk udstyr for at øge målretning nøjagtighed under tracer injektioner. Selvom metoden til anterograd og retrograd sporing hjælpcholeratoxin og dextran amin og deres respektive fluorescensmærkede konjugater er ikke ny ^9-13 (som er metoden til elektroporering, f.eks. Haas et al. ^14), kombinationen af tracer injektioner med elektroporering i et in vitro præparat involverer blokke af hjernevæv er en nyere udvikling ^7. Dens vigtigste fordel i forhold til neuronale tracing teknikker under anvendelse af den samme type tracer farvestoffer i levende dyr er den øgede mærkning intensitet, på grund af den højere effektivitet, hvormed den elektroporerede farvestoffet bliver taget op af neuroner. En yderligere fordel er den forkortede inkubationstid (kræves til farvestoffet transport) og dets øgede ønskede nøjagtighed i tracer injektion, fordi forsøgslederen har visuel kontrol over målområdet injektionsstedet. Sidstnævnte betyder også, at ingen dyre stereotaktisk udstyr er påkrævet for at finde kernen eller hjerne område af interesse.

Til suppletionelt øge målretning nøjagtighed, vi drog fordel af en transgen mus linje, som udtrykker GFP i sin glycinergic underpopulation af neuroner ^{15 og} grundlæggende optisk udstyr, der består af en håndholdt laser pointer på 405 nm bølgelængde og matchende band-pass filtrering beskyttelsesbriller (450 – 700 nm). Således opnåede vi en betydelig yderligere stigning i målretning nøjagtighed ved at identificere injektion området gennem sin fluorescerende signal og ved at give en finere måde at kontrollere for farvestoffet spredning inden injektionen område gennem observation af samspillet mellem den indfødte GFP signal og sporstoffet fluorescens. Vores teknik gør det også muligt at afdække funktionaliteten af ​​et kredsløb sammen med sin tilslutning ved at identificere GFP-positive hæmmende neuroner (eller stimulerende i andre mus linjer), der var fyldt med sporstof.

Sammenfattende vi yderligere forstærket et kraftfuldt værktøj neurovidenskabelig at studere connectome af hvirveldyr hjernen og vurdere than forskellige neuroanatomiske funktioner i en given neurocircuit. Ved at anvende transgene mus sammen med billig og bredt tilgængelige optisk udstyr var vi i stand til at øge den målsøgende nøjagtigheden af ​​vores injektioner. Desuden de transgene mus tilladt os at identificere typen af røbestof forbindelser, som hjalp afdække funktionaliteten af en hæmmende mikrokredsløb i den auditive hjernestammen.