PCR ile Gün 30 Domuz Embriyolar Doğru ve Fenol Ücretsiz DNA cinsiyet tayini
Summary
This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.
Abstract
domuz prenatal programlama içine Araştırma gelişen embriyonun veya fetüsün cinsiyet gelişim sonucunu etkilemeye göstermiştir. Bu nedenle, bir embriyonun cinsiyetini belirleme yeteneği özellikle erken gelişimi ile ilgili birçok deneyler gereklidir. Bu protokol, PCR ile kullanım için domuz genomik DNA ucuz, hızlı ve toksik olmayan hazırlanmasını ortaya koymaktadır. Gün 30 embriyolar insanca mevcut protokol için Kurumsal Hayvan Politikası ve Refah Komiteleri tarafından oluşturulan kurallara göre toplanan gerekir. Bu PCR bazlı cinsiyet tayini tekniği bütün embriyo hazırlanması sadece önceden soğutulmuş bir havan ve havan tokmağı kullanılarak ince bir toz halinde donmuş embriyo taşlama içerir. PCR kalitede DNA alkalin liziz reaktifi sıcak inkübasyon uygulayarak embriyo tozu küçük bir miktar serbest bırakılmaktadır. Daha sonra, DNA solüsyonu nötralizasyon tamponu ile karıştırılmış ve PCR için doğrudan kullanılmıştır. İki primer çiftleri DETEC için oluşturulacakyüksek doğruluk ve özgüllük ile X- kromozomunun Y kromozomu (SRY) ve ZFX bölgenin bölgesini belirleyen t özgü seks. aynı protokol gün daha önce başka bir uzun embriyolar (gün 14 gün 10) uygulanabilir 30. otomasyon ve yüksek için uygun hale embriyo çok sayıda tarama Ayrıca, bu protokol 96 dönüştü plakalı yapılabilir verim seks yazarak.
Introduction
yerli domuz, insan ve hayvan sektörlerinde gelişme, genetik ve beslenme temel bir araştırma konusu haline gelmiştir. insan araştırma için biyomedikal model olarak domuz potansiyel fizyolojik benzerlikler isnat edilebilir. Hayvancılık, cinsiyet oranı manipülasyon seçimi ve genetik iyileştirme programları 1 etkinliğini artırabilir. Bireysel embriyolar sexing dahil ancak erken embriyo gelişimi 2 sırasında genotip, epigenetik ve cinsel dimorfizm X inaktivasyonu ile sınırlı değildir, birçok deneysel araştırmalarda kullanılan temel bir araçtır.
Farelerde yapılan çalışmalar, anne beslenme ve diğer faktörler, cinsiyet dengesizliği 3 neden olabileceğini düşündürmektedir. Domuzlarda, cinsiyet oranı dengesizlik nedenleri baba cins 4, rahim kapasitesi 5 ve sow metabolik durumunu 6 içerir. embriyolar ve yavrularına gözlenen farklılıklar se etkilemiş olabilir berixual dimorfizm araştırmacılar araştırma ile ilgili kararınızı vermeden önce embriyo cinsiyet ve cinsiyet oranları farkında olmalıdır. gelişme 30. günde domuz embriyolar sexing verimli araçlar ve protokollerin geliştirilmesi burada ele alınacaktır.
seks yazarak çeşitli yöntemler model organizmaların ve hayvancılık genetik çalışmalar için geliştirilmiştir. Özellikle hayvancılık, erkek ve kadın erken embriyolar belirlenmesi ıslah programları için genetik seçimi geliştirmek için çok yaygın bir uygulamadır. Giemsa 7 veya yoğun floresan 8,9 teknikleri kullanılarak domuz Karyotipleme erken embriyolar seks yazım için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu metodlar zaman alıcı ve hızlı ve doğru bir şekilde embriyo sayıda taranması için uygun değildir.
En etkili seks yazım metodu, ısı sabit DNA polimeraz ve bir çift primer kullanılarak DNA amplifikasyon. PCR yöntemi ile DNA cinsiyet tayini O, daha özel bir hızlı ve duyarlı birnly hücresel malzemelerin bir dakika miktarda gerektirir. İlk PCR tabanlı embriyo cinsiyet tayini insanlarda 10 üzerinde gerçekleştirilir ve daha sonra fareler 11, sığır 12, manda, koyun 13 14 pre-implantasyon embriyoları oldu. Domuz, erken DNA seks yazarak yöntemi Y-kromozomu spesifik DNA primerleri 15 tek çifti üzerinden pre-implantasyon embriyoları için kurulmuştur. Bununla birlikte, cinsiyet tespiti için en yaygın PCR primerleri, bir erkek spesifik SRY 16 ve X ve Y kromozom 17 hem de yer alan bir çinko parmak geninin olmayan seks ayırt bölgenin Y kromozom seçilmiştir. Daha sonra, bu primer, bir çinko-parmağı genin sadece X kromozomu tespit etmek için primerler geliştirilmiş özgüllük bu çalışmada gün 30 embriyo cinsiyet belirleme uygulanmıştır.
domuz pre-implantasyon embriyoları genomik DNA proteinas tamponu için sağlam bir blastosist maruz bırakılarak elde edilebilire K 16 veya bireysel erken bölünme birkaç hücre biyopsi alarak 15 embriyolar ve direkt PCR için bunları kullanarak. Bununla birlikte, domuz kanı, saç, dokular ya da boyut olarak birkaç santimetre üzerinde büyük konseptus DNA salgılanmasının etkin bir şekilde proteinaz K yöntemiyle yapılmaz. Bu malzemeler için DNA ekstraksiyon yöntemleri zaman alıcı fenol / kloroform protokolleri 6 ya da pahalı sütun tabanlı kitleri 18 kullanılarak kurulmuştur. potansiyel olarak toksik kimyasalların kullanımını önlemek için, ucuz, kolay ve fenol içermeyen DNA ekstraksiyon yöntemleri geliştirmek için bir eğilim vardır. Fare 19 ve zebra balığı 20 dokularından elde edilen kalite genomik DNA izolasyonu için protokol Bu tür sıcak sodyum hidroksit ve tris (Hotshot) kullanılarak kurulmuştur. Bu çalışma, PCR seks için Hotshot değiştirilmiş ve yeniden tasarlanmış dubleks primer çiftleri Günün hücre lizatları 30 domuz embriyolar ile doğrudan yazarak DNA elde etmek için bir protokol sağlaryüksek doğruluk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Domuz embriyolar DNA seks yazarak ilgili mevcut protokollerin en erken evre öncesi implantasyon aşamasında 15,16 için uygundur. Biz başarıyla Geç gebelik sırasında domuz embriyo tarama için uygun bir protokol geliştirmiştir. Daha önceki çalışmalarda 6,18 embriyoların içindeki gelişim aşamalarında çalışmalara dayanarak, bu protokol, daha güvenli ve daha düşük maliyetli olarak kabul edilir.
Bu protokol, aynı zamanda, bir 96-yuvalı plaka için…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar işbirliği ve aşağıdaki araştırma fonu ajansı mali katkılarını kabul etmek istiyorum: Alberta Hayvancılık ve Et Ajansı Ltd., Domuz CRC, Alberta domuz, Hypor A Hendrix Genetik Firma ve NSERC CRSNG.
Materials
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used – quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
References
- Seidel, G. E. Economics of selecting for sex: the most important genetic trait. Theriogenology. 59, 585-598 (2003).
- Gutiérrez-Adán, A., et al. Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development. Reprod. Domest. Anim. 41, 54-62 (2006).
- Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review. Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).
- Gorecki, M. T. Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758). Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).
- Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig. J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).
- Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter. Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).
- Cassar, G., King, W. A., King, G. J. Influence of sex on early growth of pig conceptuses. J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).
- Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).
- Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts. PLoS One. 7, (2012).
- Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1, 347-349 (1989).
- Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos. Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).
- Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction. Theriogenology. 35, 547-555 (1991).
- Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification. Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).
- Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay. Theriogenology. 33, 245 (1990).
- Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences. Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).
- Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).
- Aasen, E., Medrano, J. F. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).
- Oliver, G., et al. Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression. Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).
- Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29, 52-54 (2000).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos. Biotechniques. 43, 610-614 (2007).
- Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts. Animal. 8, 293-299 (2014).
- Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L., Rodriguez-Martinez, Prenatal programming of postnatal development in the pig. Control of Pig Reproduction VIII. , 212-213 (2009).
