دقيقة والفينول الحرة الحمض النووي مبالغات من يوم 30 خنزيري الأجنة بواسطة PCR

أصبح الخنزير المحلي على البحوث الأساسية موضوع في التنمية، وعلم الوراثة والتغذية في القطاعين الإنسان والماشية. إمكانات الخنازير كنماذج الطبية للبحوث البشري يمكن أن يعزى إلى أوجه الشبه بينهما الفسيولوجية. في الثروة الحيوانية، ويمكن التلاعب في نسبة الجنس تعزيز فعالية اختيار والتحسين الوراثي برامج ^1. مبالغات الأجنة الفردية هو أداة أساسية تستخدم في العديد من التحقيقات التجريبية بما في ذلك ولكن لا تقتصر على النمط الجيني، التخلق وتعطيل الصبغي X من إزدواج الشكل الجنسي أثناء تطور الجنين في وقت مبكر ^2.

الدراسات على الفئران تشير إلى أن النظام الغذائي للأم وعوامل أخرى قد يؤدي إلى اختلال التوازن بين الجنسين ^3. في الخنازير، أسباب الجنس نسبة الخلل تشمل سلالة الأب ^4، قدرة الرحم ^5، وحالة زرع الأيضية ^6. منذ الاختلافات التي لوحظت في الأجنة والفضلات يمكن أن تتأثر حد ذاتهاxual إزدواج الشكل، يجب أن يكون الباحثون على علم الجنس الجنين ونسب الجنس قبل التوصل إلى استنتاجات بشأن أبحاثهم. تطوير أدوات وبروتوكولات فعالة لمبالغات أجنة الخنازير في يوم 30 من التطوير سوف تتم مناقشتها هنا.

وقد وضعت أساليب مختلفة من الكتابة الجنس للدراسات الجينية في الكائنات نموذج والثروة الحيوانية. ولا سيما في مجال الثروة الحيوانية، وتحديد الأجنة في وقت مبكر من الذكور والإناث هو ممارسة شائعة جدا لتعزيز الانتقاء الجيني لبرامج التربية. وقد استخدمت الأجنة المبكرة تنميط نووي في خنزير باستخدام بالغيمزا ⁷ أو مضان مكثفة ^8،9 تقنيات الكتابة الجنس. ومع ذلك، وهذه الأساليب هي مضيعة للوقت وغير مناسبة لفحص أعداد كبيرة من الأجنة بسرعة وبدقة.

الأسلوب الأكثر فعالية الجنس في الكتابة هو تضخيم الحمض النووي باستخدام الحرارة مستقرة البلمرة DNA وزوج من الاشعال. [سإكسينغ الحمض النووي بطريقة PCR هو أكثر تحديدا، أسرع وأكثر دقة، ستتطلب نلي كمية ضئيلة من المواد الخلوية. تم إجراء أول سإكسينغ] الجنين PCR القائم على البشر ^10، وبعد ذلك في الفئران ^11، الأنعام ^12، والجاموس والغنم ^{13 14} الأجنة ما قبل الزرع. في الخنزير، وقد تم تأسيسها في أقرب الجنس DNA طريقة الكتابة للأجنة ما قبل الزرع عبر زوج واحد من كروموسوم الاشعال DNA محددة ^15. ومع ذلك، تم اختيار الاشعال PCR الأكثر شيوعا لتحديد الجنس من Y كروموسوم من الذكور محدد SRY الجين ¹⁶ وعدم الجنس المنطقة التمييزية من الجين الزنك الاصبع الموجود في كل من X و Y كروموسوم ^17. وفي وقت لاحق، وقد تم تطبيق هذه الاشعال لتحديد جنس يوم 30 الأجنة في هذه الدراسة مع تحسين خصوصية الاشعال للكشف فقط كروموسوم X- من الجين الزنك الاصبع.

الحمض النووي الجيني من الأجنة ما قبل الزرع الخنازير يمكن استخلاصها من خلال تعريض أحد الكيسة سليمة لالعازلة مع proteinasه ك ¹⁶ أو عن طريق أخذ خزعة من عدد قليل من الخلايا من الانقسام في وقت مبكر الفردية الأجنة ¹⁵ واستخدامها لPCR المباشر. ومع ذلك، لم تفعل الإفراج عن الحمض النووي من دم الخنزير، الشعر، الأنسجة أو الحمل المستكن كبير على مدى بضعة سنتيمترات في الحجم على نحو فعال باستخدام بروتين طريقة K. تم إنشاء طرق استخلاص الحمض النووي لهذه المواد باستخدام إما تستغرق وقتا طويلا بروتوكولات الفينول / الكلوروفورم ⁶ أو مجموعات العمود مكلفة أساس ^18. من أجل تجنب استخدام المواد الكيميائية السامة، هناك اتجاه لتطوير غير مكلفة، وطرق استخراج الحمض النووي سهلة وخالية من الفينول. تم تأسيس هذا النوع من بروتوكول لعزل PCR ذات جودة الحمض النووي الجيني من الماوس ^{19 و} الزرد ²⁰ الأنسجة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الساخن وتريس (البارع). وتقدم هذه الدراسة على بروتوكول للحصول على الحمض النووي مع تعديل البارع وإعادة تصميم أزواج التمهيدي دوبلكس للPCR الجنس كتابة مباشرة من الخلية لست] من يوم 30 الأجنة الخنزير معدقة عالية.