Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

O porco doméstico tornou-se um tema de pesquisa fundamental no desenvolvimento, genética e nutrição em ambos os sectores humanas e animais. O potencial de porcos como modelo para a investigação biomédica humana pode ser atribuído às suas semelhanças fisiológicas. Na pecuária, a manipulação da proporção entre os sexos pode aumentar a eficácia dos programas de selecção ^e melhoramento genético 1. Sexagem de embriões individuais é uma ferramenta fundamental usada em muitas investigações experimentais, incluindo mas não limitado a genótipo, epigenética e X inactivação de dimorfismo sexual durante o desenvolvimento embrionário precoce ^2.

Estudos em camundongos sugerem que a dieta materna e outros fatores podem resultar em desequilíbrio entre os sexos ^3. Em suínos, as causas do sexo rácio desequilíbrio incluem raça paterna ^4, capacidade uterina ^5, e estado metabólico da porca ^6. Uma vez que as diferenças observadas em embriões e ninhadas pode ser influenciada por SExual dimorfismo, os pesquisadores devem estar cientes do sexo do embrião e relações sexuais antes de tirar conclusões sobre a sua pesquisa. O desenvolvimento de ferramentas e protocolos eficientes para a sexagem de embriões de suínos no dia 30 do desenvolvimento será discutido aqui.

Vários métodos de tipagem sexo têm sido desenvolvidos para estudos genéticos em organismos modelo e gado. Particularmente na pecuária, a identificação de embriões masculinos e femininos é uma prática muito comum para melhorar a seleção genética para programas de melhoramento. Embriões precoces cariótipo no porco usando Giemsa ^{7 ou} as intensa fluorescência ^8,9 técnicas têm sido utilizadas para tipagem sexo. No entanto, estes métodos são demorados e não é adequado para o rastreio de grandes números de embriões com rapidez e precisão.

O método sexo tipagem mais eficaz é a amplificação de DNA usando uma polimerase de ADN estável ao calor e um par de iniciadores. sexagem de DNA pelo método de PCR é mais específico, rápido e sensível, oomente requerendo uma pequena quantidade de materiais celulares. O primeiro sexagem de embriões com base em PCR foi realizado em seres humanos ^10, e mais tarde nos ratos ^{11, 12} bovinos, búfalos, ovelhas ^{13 14} embriões pré-implantação. No porco, o método de tipagem de ADN mais rapidamente do sexo foi estabelecida para os embriões pré-implantação através de um único par de Y-chromosome iniciadores de ADN específica ^15. No entanto, os iniciadores de PCR mais comuns para a determinação do sexo foram selecionados a partir do cromossomo Y do gene SRY específica do sexo masculino ¹⁶ e os não-sexo região discriminativo de um gene zinc-finger localizado na X e Y ^cromossomo 17. Subsequentemente, estes iniciadores foram utilizados para determinar o sexo dos embriões do dia 30 no estudo com uma melhor especificidade dos primers para detectar apenas o cromossoma X de um gene de dedo de zinco.

O ADN genómico a partir de embriões pré-implantação de suíno pode ser extraído por exposição de um blastocisto intacto para tamponar com proteinase K ^{16 ou} por tomar uma biópsia de algumas células da clivagem antecipada individual embriões ^{15 e} usá-los para PCR direta. No entanto, a libertação de ADN a partir de sangue de porcino, cabelo, tecidos ou um grande conceptus ao longo de alguns centímetros de tamanho não é efectivamente feito usando o método de proteinase K. Métodos de extração de DNA para estes materiais foram estabelecidas usando ou demoradas protocolos de fenol / clorofórmio ⁶ ou kits baseados coluna caro ^18. A fim de evitar o uso de produtos químicos potencialmente tóxicos, há uma tendência para o desenvolvimento de métodos de extracção de ADN de baixo custo, simples e livre de fenol. Este tipo de protocolo para o isolamento de ADN genómico por PCR qualidade do rato ¹⁹ e ²⁰ de peixe-zebra tecidos foi estabelecida usando hidróxido de sódio quente e tris (HOTSHOT). Este estudo fornece um protocolo para obter DNA com pares de primers duplex modificados Hotshot e redesenhado para o sexo PCR digitando diretamente a partir de lisados ​​celulares de dia 30 embriões de suínos comalta precisão.