نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية
Summary
Adaptive immunity is controlled by dynamic ‘immunological synapses’ formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of ‘planar cellular APC model’.
Abstract
وينظم المناعة التكيفية التي كتبها التفاعلات الدينامية بين الخلايا T ومستضد الخلايا ("ناقلات الجنود المدرعة ') يشار إليها باسم" نقاط الاشتباك العصبي المناعية. داخل هذه الواجهات خلية خلية الحميمة مجموعات فرعية الخلوية منفصلة من MHC / حج-TCR، F-الأكتين، التصاق والجزيئات يشير شكل واعادة تشكيلها بسرعة. ويعتقد أن هذه الديناميات أن تكون العوامل الحاسمة من كفاءة ونوعية الاستجابات المناعية التي تقوم بتطوير وبالتالي حماية مقابل حصانة مرضية. الفهم الحالي للنقاط الاشتباك العصبي المناعية مع فيزيولوجي ناقلات الجنود المدرعة محدودة بسبب عدم كفاية القرار تصوير الحصول عليها. رغم أن النماذج الركيزة الاصطناعية (مثل طبقات ثنائية الدهون مستو) توفر قرار ممتاز، وكانت أدوات قيمة للغاية، فهي بطبيعتها غير فيزيولوجي والتبسيط. ظهرت الأوعية الدموية واللمفاوية الخلايا البطانية بمثابة حجرة الأنسجة الطرفية هامة (أو اللحمية) من "شبه مهنةآل ناقلات الجنود المدرعة. هذه ناقلات الجنود المدرعة (التي تعبر عن معظم الآلات الجزيئية المهنية ناقلات الجنود المدرعة) لديها ميزة فريدة من تشكيل سطح الخلية مستو تقريبا وهي transfectable بسهولة (على سبيل المثال، مع الصحفيين بروتين فلوري). هنا إحدى الوسائل الأساسية لتنفيذ الخلايا البطانية كما رواية وفيزيولوجي "مستو نموذج APC الخلوي 'لتحسين التصوير والاستجواب من عمليات إشارات المستضدات الأساسية سوف يمكن وصفها.
Introduction
T الليمفاوية هي فرع من نظام المناعة التكيفية التي تتميز القدرة على التعرف على كفاءة الببتيد المستضد (حج) منضمة إلى رئيسي معقد التوافق النسيجي (MHC) الجزيئات من خلال مستقبلات الخلايا T الخاصة بهم (TCRs) 1. اللمفاويات السذاجة تهاجر بشكل جوهري ومسح "حج تقديم الخلايا المهنية" (ناقلات الجنود المدرعة، على سبيل المثال، والخلايا الجذعية) داخل الغدد الليمفاوية، بينما تحتاج خلايا الذاكرة / T المستجيب لدراسة فعالية مجموعة واسعة جدا من ناقلات الجنود المدرعة والخلايا المستهدفة المحتملة داخل الأنسجة الطرفية.
في دقيقة بعد الاعتراف الأولي وما شابه ذلك حج على APC، الخلايا اللمفية اعتقال هجرتهم والبدء في تشكيل الحميمة واجهة خلية خلية متخصصة تسمى "المشبك المناعي" (IS). أصيب (أي 30-60 دقيقة) هو يطلب من الاتصالات لتضخيم والحفاظ يشير 2-7. دراسات الناشئة تحديد ذلك ضمن IS، هو تشكيل المستمر وص السريعemodeling من الإشارات المنفصلة شبه الخلوية مجموعات صغيرة (أي التي تحتوي على MHC / حج-TCR، F-الأكتين، التصاق والجزيئات يشير) التي تحدد قوة وجودة الناتج الاستجابات المناعية 2-7. ومع ذلك، تفاصيل ديناميكية وآلية تنظيمية لهذه العملية هي غير مفهومة تماما 8،9. هذا نابع إلى حد كبير من التحديات الفنية المرتبطة طبولوجيا عدم انتظام السطوح APC والتوجه سيئة تسيطر الطائرات التفاعل خلية خلية، المسائل التي تحد عميقا في التصوير الزمانية المكانية اللازمة النهج 10/08 (Figure1A).
الشكل 1. فسيولوجي مستو نموذج APC خلية التصوير المناعية سنبس حيوية. ويوضح التخطيطي التصوير التقليدي للالمشبك المناعي بين الخلايا التائية والمهنيه نال APC (A) والخلايا التائية ومستو الدهون النموذج التقليدي طبقة ثنائية APC (B) بالمقارنة مع هذه البطانية نموذج مستو APC رواية (C). توفر ناقلات الجنود المدرعة المهنية نقاط الاشتباك العصبي المناعية الفسيولوجية ولكن تقدم سيئة موجهة اجهة خلية خلية (أي فيما يتعلق طائرة التصوير س ص المثلى؛ والقرار ~ 0.2 ميكرون)، والذي يعرض للخطر بشكل كبير المكاني (طائرة التصوير ض قرار ~ 1 ميكرون)، والزمانية (أي، بسبب الحاجة لمسح مرارا وتكرارا من خلال جميع الطائرات ض التصوير) قرار من التصوير. نماذج طبقة ثنائية لديها طوبولوجيا مستو الذي يوفر الأمثل القرار التصوير الزمانية المكانية، ولكن أيضا مبسطة للغاية، غير الفسيولوجية وجامدة. هذا النموذج الخلايا البطانية يجمع بين طوبولوجيا مستو من طبقات ثنائية الدهون مع الركيزة الفسيولوجية من APC الكلاسيكية لتقديم الأمثل القرار التصوير المكاني والزماني في وضع فيزيولوجي.م / ملفات / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
العمل السابق والتحايل جزئيا على هذه العقبات من خلال تطوير نماذج مستو الركيزة (أي طبقات ثنائية الدهون والأسطح المغلفة الأجسام المضادة) التي توفر قرار الزمانية المكانية الأمثل (أي عن طريق تحديد T تنشيط الخلايا السطحية في خطة واحدة التي هي موازية لتصوير س ص الأمثل الطائرة) 11-15 (الشكل 1B). وقد سهلت هذه النماذج معلومات هامة في ديناميات التحت خلوية / الجزيئية التي تتحكم في الإشارات المستضدات في الخلايا T، بما في ذلك اكتشاف الأكتين ديناميكية / TCR يشير-مجموعات الصغيرة 7،11-14. ومع ذلك، فإن التبسيط بطبيعتها مثل هذه النماذج، وكذلك جامدة (النافية للتنمية / دراسة الخصائص الطبوغرافية 3-الأبعاد) (الشكل 1B). ولذلك، فإنه لا يزال غير مؤكد كيفية ربط هذه النتائج إلى فيزsiologic خلية خلية المراقبة المناعية.
وإن كان لا يزال دراسة سلوكه، الأوعية الدموية والخلايا البطانية اللمفاوية آخذة في الظهور كما كبيرة (أي أكبر في أعداد من جميع ناقلات الجنود المدرعة المهنية، التي كتبها ~ 1000 مرات) حجرة الطرفية من "شبه المحترفين ناقلات الجنود المدرعة 16-18. هذه الخلايا تعبر عن MHC-I-، MHC-II- وعدد كبير من الجزيئات المشارك مشجعا (على سبيل المثال، CD40، LFA3، ICOSL، 4-1BB، OX40L، TL1A، PD-L1، ولكن لا CD80 CD86 و) وهي استراتيجيا وضعه في واجهة الأنسجة الدموية التي يعملون فيها وظائف الحارس المتخصصة 16-18. وأظهرت دراسات سابقة أن الخلايا البطانية على نحو فعال إعادة تحفيز المستجيب / الذاكرة، ولكن ليس ساذجا، وخلايا T 19-25. وبالتالي، من المرجح أن يلعب أدوار APC فريدة من نوعها في المرحلة المستجيب من الاستجابات المناعية التكيفية داخل الأنسجة الطرفية، مثل التأثير المحلي على T تنشيط الخلايا، والتمايز، والذاكرة والتسامح 16،17،26 الخلايا البطانية. CRItically، عندما نمت في المختبر، الخلايا البطانية شكل سطوح الخلايا مستو تقريبا وهي transfectable بسهولة (على سبيل المثال، مع الصحفيين بروتين فلوري). هذه الميزات هي مثالية عالية الدقة التصوير الزمانية المكانية لديناميات الطوبوغرافية خلال التفاعلات خلية خلية 19،27. وهكذا الخلايا البطانية قد تكون بمثابة فيزيولوجي "مستو الخلوي APC" النموذجية مناسبة مميزة لدراسة آليات إعادة التحت خلوية / الجزيئية التي تدفع الاعتراف مستضد وتنظيم الاستجابات (الشكل 1C) 19،20.
أنشئت سابقا تقنيات التصوير التكميلية (بما في ذلك ترنسفكأيشن من خلايا بطائن مع صانعي بروتين فلوري من غشاء البلازما والعصارة الخلوية) لدراسة تفاصيل تفاعل الكريات البيض البطانية خلال الالتصاق والهجرة transendothelial 27، أظهرت أن الكريات البيض تسبر بنشاط سطح البطانة التي كتبها ديناميكية الإدراج فيد تراجع من ميكرون نطاق الفرعي، نتوءات أسطواني الأكتين الغنية (~ 200-1،000 نانومتر في القطر والعمق) يطلق مثل invadosome نتوءات (أي، "ILPs ') 27،28. تم زيادة توسيع هذه النهج التصوير جنبا إلى جنب مع إنشاء بروتوكولات للاستفادة من البطانية وظيفة APC لتطوير أساليب الأولى لارتفاع القرار التصوير الزمانية المكانية للT خلايا البطانية المشبك المناعي كما ورد 19،20 وكذلك وصف هذا القانون. وكان من النتائج المركزي المستمدة من هذه مستو رواية الخلوية نموذج APC هو أن T ILPs خلية تعمل سواء في تعزيز الكشف حج الأولي والحفاظ على الإشارات اللاحقة. في الواقع، صفائف ILPs متعددة (التي استقرت والمستحقة في الرد المبدئي تدفق الكالسيوم) عرض تخصيب اليورانيوم في TCR والجزيئات توحي الإشارات النشطة مثل PKC-Q، ZAP-70، فسفوتيروزين وHS1. ولذلك، يبدو ILPs لتمثيل يعادل فيزيولوجي ثلاثي الأبعاد لالجزئي TCR-إشاراتمجموعات ينظر في نماذج طبقة ثنائية مستو. هذا النهج، وبالتالي، يكشف بحساسية / تقارير الديناميات الجزيئية والهندسة المعمارية (والضمنية النشاط الحيوي) لا يمكن كشفها خلاف ذلك.
الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة يجب أن يكون مفيدا في سد الفجوة بين APC المهنية والصناعية نماذج الركيزة APC من أجل تعزيز قدرتنا على استجواب الآليات الأساسية من الاستجابات المناعية التكيفية. بينما هنا يتم التركيز على تفعيل CD4 + TH1 من نوع المستجيب / خلية الذاكرة، وهذا النهج الأساسي يمكن تعديلها بسهولة لدراسة مجموعة واسعة من أنواع الخلايا T وقسم الخدمات الزراعية، كما هو مبين أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
عموما، يصف هذا البروتوكول أساليب التحقيق الخلايا البطانية وأنا) الكافي في ناقلة جنود مصفحة الفسيولوجية والثاني) كنوع من رواية 'مستو نموذج APC الخلوي. وفيما يتعلق السابق، فقد أصبح موضع تقدير على نحو متزايد أن ناقلات الجنود المدرعة غير لدم الطرفية (أو اللحمية ') تلعب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Peter T. Sage for his assistance in generating some of the representative images. This work was supported by an NIH R01 grant to C.V.C. (HL104006).
Materials
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
- Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell – dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
- Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
- Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
- Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
- Martinelli, R., Carman, C. V., Bradshaw, R. A., Stahl, P. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. , (2015).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
- Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?. Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
- Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
- Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
- Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
- Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
- Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
- Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
- Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
- Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
- Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
- Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by ‘invadosome-like protrusions’. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
- Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
- Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
- Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
- Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
- Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
- Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
- Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
- Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
- Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).
