Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

La zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), en las paredes del ventrículo lateral hacia el cuerpo estriado, es una región germinal muy activo en el que un proceso continuo de replicación de células progenitoras y de diferenciación como resultado la producción persistente del bulbo olfatorio (OB interneuronas) y oligodendrocitos del cuerpo calloso ^1. La generación de toda la vida de estas células parece estar apoyada por la presencia en esta región de las células madre neurales (NSC, también llamadas células B1), que expresan la proteína ácida glial fibrilar antígeno de los astrocitos (GFAP) y marcadores de células tales como nestina, Id1 madre y Sox2 ^2. Que expresan GFAP células B1 generan células (TAP) (células C), que expresan factores de transcripción Dlx2 tránsito amplificar progenitora (distal-less homeobox 2) y Ascl1 (mamíferos achaete-Schute homólogo 1) y dividir rápidamente un par de veces antes de que den origen a neuroblastos migran (células a) o oligodendroblasts ^3. Recién generada prolifeneuroblastos rativa migran hacia delante, formando la corriente migratoria rostral (RMS) para el OB, en la que se integran en el granulares y capas glomerulares como interneuronas inhibitorias diferenciadas. Migración de oligodendroblasts jóvenes se mueven a la CC, donde se convierten en células NG2 positivo inmaduras que siguen dividiendo a nivel local o diferenciarse en oligodendrocitos maduros myelinating ^1,4.

células B1, que derivan de las células gliales radiales fetales, conservan la morfología alargada y polarizada de sus predecesores y exhiben una relación altamente especializada con su nicho. Ellos abarcan entre el epéndimo, que se alinea el ventrículo y la red de vasos sanguíneos que irrigan el nicho V-SVZ. El pequeño proceso apical de las células se intercala entre B1 ependymocytes multiciliated y termina en un solo cilio primario no móvil, que en los procesos basales se extiende largas distancias para abordar el plexo vascular plana que irriga este nicho de final en el basal lámina de los capilares del plexo ^2,5-8.

La forma más fiable para distinguir B1-NSC a partir de astrocitos no neurogénicos, que también son GFAP ^+, en el nicho intacta V-SVZ se basa en todo el montaje de preparaciones de la pared lateral del ventrículo y su análisis por microscopía confocal 3-D después de inmunotinción para GFAP para etiquetar el proceso apical B1-NSC delgada, β-catenina para delinear las membranas celulares, y, o bien γ-tubulina como un marcador de cuerpos basales ciliar o acetilado α-tubulina para etiquetar la extensión de cada cilio ^5,8. Las observaciones de estos enteros monturas de la superficie ventricular han indicado que las células ependimales B1 y están dispuestas en ^"molinetes" 5, en el que los procesos apicales uniciliated de uno o varios GFAP ^{+ células} B1 están rodeadas por una roseta de células ependimarias multiciliated.

La morfología característica de células B1 se correlaciona con la evidencia experimental indicating que los vasos sanguíneos células endoteliales y ventriculares / líquido cefalorraquídeo (LCR) constituyen las fuentes reguladas de señales solubles que actúan sobre células madre neurales ^2,6,9-11. En la superficie ventricular, y las interacciones homotipica heterotípicos apico-lateral con células ependimarias y B1 incluir uniones estrechas y uniones adherentes ^5,12. Por otra parte, las moléculas de adhesión implicadas en los complejos de unión entre las células B1 y ependimarias, tales como N-cadherina y V-CAM, se ha demostrado que regular no sólo el posicionamiento altamente organizada de B1 en el nicho de V-SVZ, sino también su quiescencia ^{12 , 13.} La monocapa de células ependimarias-B1 parece actuar como una barrera de difusión que permite el flujo regulado de agua y las moléculas pequeñas de la CSF, pero restringiendo el paso intercelular de proteínas grandes ^10,11. La evidencia experimental indica que la celda B1 cilio apical posición única podría desempeñar un papel como un sensor de polipéptidos presentes en el LCR ² de ^{señalización,}5-7. Las células ependimarias son, per se, también una fuente de señales solubles y unidas a la membrana con un papel en la regulación del comportamiento NSC ^14,15.

Nucleósidos trazables, tales como bromo-desoxiuridina (BrdU), o retrovirus han sido ampliamente utilizados para marcar las células progenitoras, incluyendo NSCs, in vivo. Sin embargo, estos métodos no son óptimas para el rastreo destino a largo plazo ya que las señales BrdU diluido a través de repetidas divisiones celulares y retrovirus parecen estar dirigidas preferentemente de forma transitoria células debido a su requerimiento de la proliferación celular para la transducción ^16,17 amplificar. Para examinar NSC fisiología in vivo, incluyendo las interacciones con los componentes de nicho, es crucial establecer un método para etiquetar y rastrear células rara vez se dividen, como B1-NSCs son en gran parte de reposo y sus células ependimarias vecinos nunca se dividen en condiciones fisiológicas ^3. Aquí, se muestra que los vectores lentiviral (LV) permiten una marca de genes de alta eficienciaING y modificación a largo plazo de NSCs adultas y que no se dividen las células ependimales, debido más razonablemente a su capacidad para transducir y para integrarse en el genoma de las células diana de una manera independiente del ciclo celular. Por otra parte, se muestra cómo la vía de administración y virales ayuda título para transducir específicamente a las células ependimarias, pero no los linfocitos B1 permitiendo así que el análisis de nichos dependiente, efectos ependimarias en células madre neurales.