Стабильной и эффективной генетической модификации клеток у мышей взрослых V-СВЗ для анализа нейронных стволовых клеток автономный и Неавтономные эффекты

Мышиный желудочка-субвентрикулярная зона (V-SVZ), в стенках бокового желудочка, обращенной к полосатое тело, является очень активным зародышевых область, в которой непрерывный процесс репликации и дифференцировки клеток-предшественников приводит к стойким производства обонятельной луковицы (OB ) интернейронов и мозолистого тела олигодендроциты ^1. Пожизненное поколение этих клеток, как представляется, подтверждается наличием в этом регионе нейронных стволовых клеток (НСК; также называемым B1 клеток), которые выражают астроцитов антиген глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и стволовых клеточных маркеров, таких как нестина, Id1 и Sox2 ^2. GFAP-экспрессирующих B1 клетки вырабатывают транзит усиливающую прародителя (TAP) клетки (C клеток), которые выражают транскрипционные факторы Dlx2 (дистальный менее гомеобоксный 2) и Ascl1 (млекопитающих achaete-schute гомолог 1) и разделить быстро несколько раз, прежде чем они порождают чтобы мигрирующих нейробластов (клетки а) или oligodendroblasts ^3. Недавно созданный Пролифerative нейробласты мигрируют кпереди, образуя ростральный миграционный тракт (RMS) на ОВ, где они интегрироваться в гранулированных и клубочков слоев как дифференцированных ингибирующих интернейронов. Перенастройка молодые oligodendroblasts двигаться в ЦК, где они становятся незрелые NG2-позитивных клеток, которые продолжают делить локально или дифференцироваться в зрелые myelinating олигодендроцитов ^1,4.

B1 клетки, которые вытекают из эмбриональных радиальных глиальных клеток, сохраняют вытянутую и поляризованный морфологию своих предшественников и имеют узкоспециализированный отношения с их нишу. Они охватывают между Эпендима, которая выстраивается желудочка и сети кровеносных сосудов, что орошать V-СВЗ нишу. Небольшой верхушечный процесс B1 клеток интеркалатов среди multiciliated ependymocytes и заканчивается в одной неподвижные первичной реснички, а их базальная процесс распространяется на большие расстояния, чтобы подойти к плоскую сосудистого сплетения, что орошает эту нишу окончание в бASAL пластинка из сплетения капилляров ^2,5-8.

Самый надежный способ отличить B1-НСК из экологически нейрогенных астроцитов, которые также GFAP ^+, в неповрежденной V-СВЗ нише основан на весь монтажа препараты желудочка боковой стенке и их анализ от 3-D конфокальной микроскопии после иммунным для GFAP маркировать тонкие В1-НСК апикальная процесса, -катенин очертить клеточные мембраны, и либо γ-тубулина в качестве маркера cilial базальных телец или ацетилированный альфа-тубулина для мечения степень каждой реснички ^5,8. Наблюдения этих цельного монтирует из желудочков поверхности показали, что B1 и эпендимные клетки расположены в "флюгеры" ^5, в которой uniciliated апикальные процессы одного или нескольких GFAP ^{+ B1} клеток окружены розеткой multiciliated эпендимных клеток.

Характерная морфология B1 клеток коррелирует с экспериментальными данными яndicating, что кровеносные сосуды / эндотелиальные клетки и желудочковой цереброспинальной жидкости (ликвора) составляют регулируемые источники растворимых сигналов, действующих на НСК ^2,6,9-11. В желудочковой поверхности, гомотипических и гетеротипические апикально-боковой взаимодействий с участием эпендимные и B1 клеток включают плотные соединения и слипчивые соединения ^5,12. Кроме того, молекулы адгезии, вовлеченные в соединительных комплексов между B1 и эпендимных клеток, таких как N-кадгерина и V-CAM, как было показано, регулирует не только высоко организованную позиционирование B1 в V-SVZ нише, но также и их неподвижность ^{12 , 13.} Клеточный монослой эпендимные-В1-видимому, действует в качестве диффузионного барьера, позволяющего регулируемое поток воды и малых молекул от CSF, но ограничивая межклеточное прохождение крупных белков ^10,11. Экспериментальное доказательство показывает, что в уникальном положении В1 клеток апикальной ресничка может играть определенную роль в качестве датчика сигнализации полипептидов, присутствующих в CSF ^2,5-7. Эпендимные клетки, как таковой, также является источником растворимых и мембраносвязанных сигналов с роли в регуляции поведения НСК ^14,15.

Прослеживаемые нуклеозиды, такие как бром-дезоксиуридина (BrdU), или ретровирусов широко были использованы для обозначения клетки-предшественники, в том числе NSC, в естественных условиях. Тем не менее, эти методы не являются оптимальными для долгосрочного отслеживания судьбы, потому что BrdU сигналы разбавить путем многократных делений и ретровирусов клеток, по всей видимости преимущественно нацелены временно усиливая клетки из-за их требованию клеточной пролиферации для трансдукции ^16,17. Чтобы исследовать НСК физиологию в естественных условиях, в том числе взаимодействия с компонентами ниши, очень важно создать способ маркировать и отслеживать редко делящиеся клетки, а B1-НСК в основном в состоянии покоя и их соседние эпендимные клетки никогда не разделить в физиологических условиях ^3. Здесь мы покажем, что лентивирусов векторов (ПЗ) позволяют отметки гена высокоэффективнойING и долгосрочное изменение взрослых НСК и без разделительных эпендимных клеток, из-за наиболее разумно с их способностью к трансдукции и интеграции в геном клетки-мишени в пути клеточного цикла-независимыми. Кроме того, мы покажем, как маршрут доставки и титр вируса помощью специально преобразовывать эпендимные клетки, но не В1 клетки, тем самым позволяя анализировать ниши-зависимыми, эпендимных воздействия на НСК.