Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

A zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), nas paredes do ventrículo lateral de frente para o corpo estriado, é uma região germinal muito activa, na qual um processo contínuo de replicação de células progenitoras e diferenciação resulta na produção persistente de bolbo olfactivo (OB ) interneurônios e oligodendrócitos corpo caloso ^1. A geração ao longo da vida destas células parece ser apoiada pela presença nesta região de células neurais estaminais (NCCC, também chamado células B1), que expressam a proteína ácida fibrilar glial antigénio astrócitos (GFAP) e a haste marcadores celulares, tais como a nestina, Id1 e Sox2 ^2. GFAP-expressando células B1 gerar células (TAP) (células C), que expressam fatores de transcrição Dlx2 trânsito ampliando progenitor (distal-less homeobox 2) e Ascl1 (mamíferos achaete-Schute homólogo 1) e se dividem rapidamente algumas vezes antes de dar lugar a neuroblastos que migram (células a) ou oligodendroblasts ^3. Recém-gerado prolifneuroblasts operatória migrar anteriormente, formando o fluxo migratório rostral (RMS) para o OB, onde eles integrar o granular e camadas glomerular como interneurônios inibitórios diferenciados. A migração de jovens oligodendroblasts passar para o CC, onde eles se tornam células imaturas NG2-positiva que continuam a dividir localmente ou se diferenciar em oligodendrócitos myelinating maduros ^1,4.

células B1, que derivam de células gliais radiais fetais, retêm a morfologia alongada e polarizada de seus antecessores e exibem uma relação altamente especializada, com o seu nicho. Eles abrangem entre a ependyma que alinha o ventrículo e da rede de vasos sanguíneos que irrigam o nicho V-SVZ. O pequeno processo apical das células intercala B1 entre ependimócitos multiciliated e termina em um único cílio primária não-móveis, ao passo que o seu processo basal estende longas distâncias para abordar o plexo vascular planar que irriga este nicho final no blamina asal dos capilares do plexo ^2,5-8.

A maneira mais confiável para distinguir B1-NSCs a partir de astrócitos não-neurogênicas, que também são GFAP ^+, no nicho V-SVZ intacto é baseado em preparações com parede lateral do ventrículo e sua análise por microscopia confocal 3-D de toda a montar depois imunocoloração para GFAP para rotular o processo apical fina B1-NSC, β-catenina para delinear as membranas celulares, e ambos os γ-tubulina como um marcador de corpos basais cilial ou acetilado α-tubulina para rotular a extensão de cada cílio ^5,8. Observações destas montagens inteiras-a partir da superfície do ventrículo indicaram que as células ependimais e B1 estão dispostas em "" cata-ventos ^5, em que os processos apicais uniciliated de um ou vários GFAP ⁺ B1 células são cercadas por uma roseta de células ependimais multiciliated.

A morfologia característica de células B1 correlaciona-se com a evidência experimental indicating que os vasos sanguíneos / células endoteliais e ventriculares líquido cefalorraquidiano (LCR) constituem fontes reguladas de sinais solúveis que agem em NSCs ^2,6,9-11. Na superfície ventricular, homot�ica e interações APICO-lateral heterotípicos envolvendo células ependimárias e B1 incluem junções apertadas e junções aderentes ^5,12. Além disso, as moléculas de adesão implicados nos complexos juncionais entre as células B1 e ependimais, tais como N-caderina e V-CAM, têm sido mostrados para regular não só o posicionamento altamente organizada de B1 no nicho V-SVZ, mas também a sua quiescência ^{12 , 13.} A monocamada de células ependimária-B1 parece actuar como uma barreira de difusão, permitindo o fluxo regulado de água e pequenas moléculas a partir do CSF, mas restringindo a passagem de grandes proteínas intercelular ^10,11. A evidência experimental indica que o cílio apical de células B1 singularmente posicionada poderia desempenhar um papel como um sensor de sinalização polipeptídeos presentes no CSF ^2,5-7. Células ependimais são, por si só, também uma fonte de sinais solúveis e ligadas à membrana, com um papel na regulação do comportamento NSC ^14,15.

Rastreáveis ​​nucleósidos, tais como bromo-desoxiuridina (BrdU), ou retrovírus têm sido amplamente utilizados para marcar células progenitoras, incluindo as NSC, in vivo. No entanto, estes métodos não são ideais para o rastreio destino a longo prazo em virtude dos sinais de BrdU diluído através de divisões celulares utilizadas e retrovírus parecem ter como alvo, preferencialmente, de forma transiente células, devido à sua exigência de proliferação celular para a transdução ^16,17 amplificar. Para examinar NSC fisiologia in vivo, incluindo interações com componentes de nicho, é fundamental estabelecer um método para rotular e rastrear células raramente se dividem, como B1-NSCs são em grande parte de repouso e as suas células ependimárias vizinhos Nunca dividir em condições fisiológicas ^3. Aqui, mostramos que vetores de lentivírus (VEs) permitir a marca de gene de alta eficiênciação e modificação de longo prazo de NSC adultas e células ependimais que não se dividem, devido razoavelmente mais a sua capacidade para transduzir e a integrar-se no genoma das células alvo de um modo independente do ciclo celular. Além disso, mostramos como a rota de entrega e viral título de ajuda para transduzir especificamente células ependimárias, mas não células B1 permitindo assim a análise dos efeitos, ependimárias dependente de nicho no NSC.