İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme
Summary
Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.
Abstract
Dendritik dikenler, merkezi sinir sisteminde, uyarıcı sinapsların post-sinaptik bölmelere karşılık küçük çıkıntılar vardır. Onlar dendritler boyunca dağıtılır. Onların morfolojisi nöronal aktivitenin büyük ölçüde bağlıdır ve onlar dinamik. Dendritik dikenler yüzeylerinde ve postsinaptik yoğunluğu seviyelerinde glutamaterjik reseptörleri (AMPA ve NMDA reseptörleri) ifade etmektedir. Her omurga nöron bağımsız olarak devlet ve yerel aktivite kontrol etmenizi sağlar. Omurga morfolojileri yoğun in vivo yaklaşımları ve kemirgen dokularından elde edilen nöronal kültürler her ikisini de kullanarak, beyin korteksinin glutamaterjik piramit şeklindeki hücrelerinde incelenmiştir. Kemirgen kültürlenmiş nöronlar ve tek boyutlu nicel analiz 1 'de gösterildiği gibi nöropatolojik koşulları, değiştirilmiş omurga indüksiyon ve olgunlaşması ile ilişkili olabilir. Bu çalışmada, insan cortic kullanarak omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz için bir protokol tanımlamaktadırnöral kök hücreler (geç kortikal atalarıdır) türetilen al nöronlar. Bu hücreler, ilk uyarılmış pluripotent kök hücreler elde edildi. Bu protokol, farklı kültür dönemlerinde omurga morfolojileri analizi sağlar, ve psikiyatrik hastalığı olan hastalardan elde edilen kontrol bireylerden elde edilen uyarılmış pluripotent kök hücreler arasındaki olası karşılaştırılması.
Introduction
Kortikal piramidal nöronların Dendritik dikenleri kemirgen, primat, insan beyninin, bu nöron alt tiplerinin bazal ve apikal dendritler boyunca dağıtılmıştır küçük ve ince çıkıntılar bulunmaktadır. Bunlar en uyarıcı sinaps siteleri ve öğrenme ve bilişsel süreçlerde önemli fonksiyonları görüntülemek. İnsan dendritik dikenler detaylı yapıları teknik elektron mikroskobu 2 tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, zaman alıcıdır ve ağır iş yükünü temsil eder. Daha yakın zamanda, dendritik dikenler morfoloji üç boyutlu (3D) yeniden büyük el omurga analizi 3 kombine özel bir yazılım kullanılarak insan beyin korteksinde bildirilmiştir.
Immünofloresan bağlanmış yeşil floresan protein (GFP) teknolojisi floresan mikroskop ile omurga tespiti ve şekil ölçümü için doğru bir aracı temsil eder. Bu yaklaşım kolayca kültür nöronları için uygulanabilir. However, veriler uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) elde edilen insan nöronlar üzerinde omurga olgunlaşması ve morfoloji analizi bildirilmiştir.
Bu çalışmanın amacı, in vitro kültürlenmiş insan nöronlardan dendritik omurga görüntüleme sağlayan bir protokol, tanımlamaktır. Imaris yazılımının Filament Tracer modülü ile GFP etiketleme, konfokal mikroskopi ve 3D analiz, mevcut protokolü kullanılmıştır. II nöral kök hücrelerden IV (NSC) için katmanları kortikal nöronlar glutamaterjik elde etmek için gerekli olan kültür adımlar da burada açıklanan kısaca. İnsan MGK üretimi için tüm protokol zaten başka bir yerde 4 yayımlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Piramidal nöronlar morfolojik özelliklerinin ölçümü yazılımı dayanıyordu. Filament Tracer arayüzü nöronların ve dikenler segmentasyonu için kullanıldı ve XT modülü kendi analiz için kullanıldı.
Bizim teknik doğruluğunu analiz etmek, öncelikle kültür 6, 7 ve insan beyin dokularında 3 sıçan olgun piramidal nöronlar kullanarak yayınlanan olanlar ölçülen morfolojik parametreleri (uzunluk, alan ve toplam omurga hacmi uygulanabilir), karşı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
References
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).
