Трехмерная Количественное дендритных шипиков пирамидальных нейронов из производных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
Summary
Дендритных шипиков пирамидальных нейронов сайты большинства возбуждающих синапсов в коре головного мозга млекопитающих. Этот метод описан 3D количественный анализ позвоночника морфологии в корковых нейронов пирамидальной глутаматэргических человека, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
Abstract
Дендритные шипы небольшие выступы, соответствующие постсинаптических отсеков возбуждающих синапсов в центральной нервной системе. Они распределены по дендритов. Их морфология во многом зависит от активности нейронов, и они являются динамическими. Дендритных шипиков выразить глутаматергические рецепторы (АМРА и NMDA рецепторы) на их поверхности и на уровне постсинаптической плотности. Каждый позвоночника позволяет нейрон контролировать его состояние и местного деятельность самостоятельно. Позвоночник морфологии были тщательно изучены в глутаматергических пирамидальных клеток коры головного мозга, с помощью обоих подходов в естественных условиях и нейронные культуры, полученные из тканей грызунов. Нейропатологическое условия могут быть связаны с измененной позвоночника индукции и созревания, как показано на грызунах, культивируемых нейронов и одномерная количественного анализа 1. Настоящее исследование описывает протокол для 3D количественного анализа морфологии позвоночника с использованием человеческой corticаль нейроны, полученные из нервных стволовых клеток (в конце корковых клеток-предшественников). Эти клетки были первоначально получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Этот протокол позволяет проводить анализ позвоночника морфологии в разные периоды культуры, и с возможностью сравнения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из контрольных лиц с данными, полученными от пациентов с психиатрических заболеваний.
Introduction
Дендритных шипиков корковых пирамидных нейронов являются малые и тонкие выступы, которые распределены вдоль базальных и апикальных дендритов этих нейронов подтипов грызунов, приматов и человека мозг. Они сайты большинства возбуждающих синапсов и отображать ключевые функции в обучении и когнитивных процессов. Подробные структуры дендритных шипиков человека были технически изучал с помощью электронного микроскопа 2. Тем не менее, такой подход требует много времени и представляет большую нагрузку. Совсем недавно, трехмерное (3D) реконструкция морфологии дендритных шипов было сообщено в человеческой коры головного мозга с помощью специального программного обеспечения в сочетании с большой ручной анализ позвоночника 3.
Зеленый флуоресцентный белок (GFP), технологии в сочетании с иммунофлуоресценции представляет собой точный инструмент для идентификации позвоночника и измерения формы флуоресцентной микроскопией. Этот подход может быть легко наносится на культивируемых нейронах. Хоувер, никакие данные не были зарегистрированы на анализе позвоночника созревания и морфологии на человека нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).
Целью данного исследования было описать протокол, который позволяет дендритных позвоночника изображений из культивированных человеческих нейронов в пробирке. GFP маркировки, конфокальной микроскопии и 3D анализ с помощью модуля нити Tracer программного обеспечения Imaris были использованы в настоящем протоколе. Культура шаги, которые необходимы для получения корковых нейронов глутаматергические слоев II к IV от нервных стволовых клеток (НСК), также кратко описаны здесь. Вся протокол для производства человеческого НСК уже были опубликованы ранее 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количественное определение морфологических особенностей пирамидальных нейронов полагаются на программное обеспечение. Интерфейс нити Tracer был использован для сегментации нейронов и шипов, и модуль XT был использован для их анализа.
Для анализа точности нашей техники, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
References
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).
