Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen
Summary
Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.
Abstract
Dendritische kleine uitsteeksels die overeenkomen met de postsynaptische compartimenten van exciterende synapsen in het centrale zenuwstelsel. Ze zijn verdeeld langs de dendrieten. De morfologie is grotendeels afhankelijk van neuronale activiteit en de dynamiek. Dendritische stekels uiten glutamaat receptoren (AMPA en NMDA-receptoren) op hun oppervlak en op het niveau van postsynaptische dichtheden. Elke rug kan de neuron zijn staats-en lokale activiteiten zelfstandig te regelen. Spine morfologieën zijn uitgebreid bestudeerd in glutamaterge piramidale cellen van de hersenen cortex hand van in vivo technieken en neuronale cultures verkregen uit knaagdieren weefsels. Neuropathologische aandoeningen worden geassocieerd met veranderde wervelkolom inductie en rijping, zoals in knaagdieren gekweekte neuronen en eendimensionaal kwantitatieve analyse 1. De huidige studie beschrijft een protocol voor de 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie met menselijke cortical neuronen afgeleid van neurale stamcellen (late corticale voorouders). Deze cellen werden aanvankelijk verkregen van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Dit protocol maakt de analyse van de wervelkolom morfologieën in verschillende perioden cultuur, en met mogelijke vergelijking van geïnduceerde pluripotente stamcellen verkregen uit controle individuen met die verkregen bij patiënten met psychiatrische aandoeningen.
Introduction
Dendritische stekels van corticale piramidale neuronen zijn klein en dun uitsteeksels die zijn verdeeld over de basale en apicale dendrieten van deze neuronale subtypes in knaagdieren, primaten en menselijke hersenen. Zij zijn de sites van de meest prikkelende synapsen en belangrijke functies in het leren en cognitieve processen weer te geven. De gedetailleerde structuur van de menselijke dendritische stekels zijn technisch bestudeerd door elektronenmicroscopie 2. Dergelijke benadering tijdrovend en vertegenwoordigt hoge werkdruk. Meer recent heeft een driedimensionale (3D) reconstructie van de morfologie van de dendritische gemeld in menselijke hersenen cortex met behulp van specifieke software gecombineerd om grote handmatige analyse ruggengraat 3.
Groene fluorescentie eiwit (GFP) technologie gekoppeld met immunofluorescentie een exacte hulpmiddel voor de identificatie en meting ruggengraat vorm door fluorescentiemicroscopie. Deze benadering kan eenvoudig worden toegepast op gekweekte neuronen. However zijn geen gegevens gemeld op de analyse van de wervelkolom rijping en morfologie menselijke neuronen afkomstig van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC).
Het doel van deze studie was om een protocol dat dendritische spine beeldvorming uit gekweekte humane neuronen in vitro mogelijk maakt te beschrijven. GFP etikettering, confocale microscopie en 3D-analyse van de gloeidraad Tracer module van Imaris software werden gebruikt in het huidige protocol. Cultuur stappen die nodig zijn om corticale glutamaterge neuronen lagen te verkrijgen II tot IV van neurale stamcellen (NSC) zijn ook hier in het kort beschreven. De gehele protocol voor menselijke NSC productie is reeds elders 4 gepubliceerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kwantificering van de morfologische kenmerken van piramidale neuronen gebruikt de software. De Filament Tracer-interface werd gebruikt voor segmentatie van neuronen en stekels, en XT module werd gebruikt voor de analyse.
Om de nauwkeurigheid van onze techniek te analyseren, we eerst vergeleken de gemeten morfologische parameters (lengte, oppervlakte, en het totale volume ruggengraat indien van toepassing), met die gepubliceerd met de rat volwassen piramidale neuronen in cultuur 6, 7 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
References
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).
