This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.
T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (µM range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.
Более глубокое понимание того, как Т-клетки распознают антигены требует рассмотрения в нужном месте, то есть, в иммунологической синапса, образованном между Т-клетки и АПК. Здесь молекулярные обязательные кинетики определяется не только присущими биохимических свойств партнеров взаимодействия участвующих, но зависит в значительной степени от сотовых параметров, которые включают в себя клеточные силы, мембранный архитектуры и латеральных взаимодействий между мембранными белками, а также синапсов конкретных геометрических ограничений 3. Биохимические подходы ограничены в разрешающей способности, поскольку они требуют срыва по меньшей мере одного из синаптических мембран, участвующих. По этой причине методика визуализации FRET основе был разработан, чтобы следить за связывание TCR с антигенными pMHCs 2. Здесь Т-клетки украшены рекомбинантного и сайт-специфически помечены TCR & beta;-реактивного единая цепь фрагмент антитела (SCF V) и столкнулся с планом соток стеклянные поддержке липидных двойных слоев (SLBS), которые несут молекулы МНС класса II, загруженные с флуоресцентно-меченного пептида, антигенного костимулирующих молекулы адгезии и белки. Synaptic связывания красителя помечены TCR и красить меченных результатов ПКИКЖ в ладу, которые могут контролироваться на уровне оптом и одной молекулы полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопии.
В данной статье подробно описано, как использовать SLBS дл анализа Т-клеточных синапсов, проверки их целостности через функциональную Т-клеток кальцием поток анализа, проведение FRET измерения в объеме и с чувствительностью единичных молекул, и анализировать полученные данные. Рекомендации предлагается производить правильно соотнесены белки, необходимые для двухслойной функционализации. Для получения более подробной информации о формировании двухслойной и настройки подходящего TIRF микроскоп пожалуйста, обратитесь к дополнительному общественного доступа Юпитер публикации, опубликованной в увязке 4.
палатка "> Природа SLBSМодифицируемыми SLBS может быть легко генерируется из однослойных везикул (SUV), содержащий два липидов 1-пальмитоил-2-олеоил-Sn-gylcero-3-фосфохолин (короткий: POPC, 90-99%) и 1,2-dioleoyl- SN – глицеро-3 – {[Н (5-амино-1-карбоксипентил) иминодиуксусной кислоты] сукцинил} (короткий: АРД НТА-Ni, 1-10%). Внедорожники распространяются на чистых стеклах, чтобы сформировать непрерывную плоскую бислой 4. DGS-NTA-Ni служит для закрепления полигистидином тегами белки с помощью полигистидинового-опосредованной комплексообразования с синтетическим НТА-Ni-содержащей глава группы (рис 1А). Для стабильной ассоциации одного, как правило, заменяет родной трансмембранный домен и цитоплазматический хвост адгезии белка ICAM-1 и костимулирующей молекулы В7-1 с одной меткой, содержащей двенадцать гистидинов (ICAM-1-12H, В7-1) -12Н (Фигура 1В) , Пептид-класс загружен молекула II Е. К содержит два мембраной встроены (α β и) полипептидную цепьс. Трансмембранные / цитоплазматические домены обеих цепей должны быть заменены с меткой, содержащей шесть гистидинов друг (IE K α β 6H 6H или IE к -2x6H). В качестве альтернативы, проходящей альфа-цепь с двенадцатью гистидинов и оставляя внеклеточный домен бета-цепи без тегов (давая начало IE к альфа 12H бета 0H или IE K -12Н) приводит к удовлетворительным результатам (рис 1B).
Сайт-специфическая маркировка pMHCs
Важно маркировать рМНС стехиометрически и сайт-специфически, чтобы иметь возможность конвертировать измеренные FRET урожайности в значимые равновесных констант связывания. Это может быть достигнуто путем химического маркировки синтетического пептида, который загружен в пептидной связывания щели рекомбинантного гистидин-меченый молекулами МНС класса II 2,5. Пептид включает в себя все остатки Т-клеточного эпитопа, как WELL как короткий С-концевой линкер (GGS) с последующим цистеина (например, в моли цитохром с (MCC), пептидов ANERADLIAYLKQATK- GGSC, линкер выделены жирным шрифтом). Это цистеин используется для обозначения пептида стехиометрически с использованием производных малеимид-краситель. На данный момент дополнительный уход должен быть посвящен проверке количественную краситель-связь в цистеин-содержащих пептидов. ВЭЖХ-очистки аддукта пептид-краситель рекомендуется и должен быть затем ионизация электрораспылением масс-спектроскопии. Любые записанные массы, соответствующие пептидной эдукта (без красителя) отражают неполную маркировку. Если это так, то ВЭЖХ-очищенный пептид должен быть подвергнут последовательных раундах красителя маркировки до маркировка не считаются количественными. Следует отметить, что MALDI-TOF масс-спектроскопии, следует избегать, так как это метод включает лазерное излучение для ионизации образца. Это лечение распадается прикрепленные чувствительные флуорофоры, прежде чем пептид масса считывается и, таким образом, underrepre сентов градусов красителя сопряжения.
Косвенное же сайт-специфического маркировка клеточных связанного TCR, с использованием одновалентного одноцепочечных фрагментов F V
Он по-прежнему бросает вызов, чтобы прикрепить красители для клеточной поверхности белки, связанные живых клеток в сайт-специфическим образом. Для преодолеть это препятствие для поверхностно-подвергается ТКО, версия одновалентной единая цепь (SCF V) от генов TCR & beta; -reactive моноклональных антител H57-197 2 был построен. Кристаллическая структура этого антитела в комплексе с TCR позволяет рационально сконструировать версию, в которой остаток серина в непосредственной близости к С-концу МНС связанного пептида (где соответствующий FRET партнер краситель прилагается) подменяется остаток цистеина. Этот мутант цистеин затем служит в качестве акцептора для красителя сопряжения (рис 2).
Методологии для записи FRET
нт "> Массовые значения FRET лучше всего подходят для проверки соотношения между расстояниями выбранных среди красителях и FRET эффективность, измеренные в этом TCR-рМНС системы 2 связывания. Кроме того, измерения сыпучих FRET выявить количественные и качественные различия в синаптических сродства ТКР ПКИКЖ ( см ниже и раздел протокола 3.2). Различные подходы к количественной FRET эффективности были введены в литературе 6. В этой статье FRET записывается с помощью(а) восстановление после доноров акцепторной отбеливания, и через
(б) сенсибилизированные FRET акцепторный излучение.
Первый способ (а) требует использование FRET акцептором, что может быть легко photobleached и донора, что является довольно фотостабилен. Кроме того, важно, чтобы убедиться, что photobleached акцептор больше не способен закалки флуоресценции донора. Как же канал обнаружения (донор) используется для количественного коррекция не факторизуютD Нет хроматические аберрации не должны рассматриваться, что делает эту методологию простой и надежный. Тем не менее, количественные измерения не могут быть повторены на том же месте образца и изменения в FRET не могут быть записаны в течение долгого времени. Чтобы избежать последствий, вызванных молекулярной диффузии или подвижности сотовой быстро шаг отбеливания должна быть направлена на, что сводит к минимуму время, которое проходит между первым FRET донора (до акцепторного отбеливания) и приобретения второго изображения FRET доноров (после FRET акцепторной отбеливания). Это рекомендуется использовать мощный источник лазерного излучения лада акцептора возбуждения волны для того, чтобы освещенность и отбеливающие раз.
В противоположность этому, в подходе сенсибилизированной измерения выбросов FRET (б) донор FRET возбуждается и испускание FRET акцептором наблюдается в ладу акцепторной канала. Изменения в FRET акцептора сигнала может быть записана в течение долгого времени, но эмиссии донора FRET в красное смещение канала акцептора (тermed bleedthrough) и FRET акцепторный кросс-возбуждение с помощью возбуждения доноров должны быть точно определены и вычитается из записанного FRET акцепторной канала. Для этого соответствующие FRET донора и акцептора ладу изображения должны быть пространственно совмещены.
Обнаружение одной молекулы (см) FRET события
При использовании лазеров в качестве источника возбуждения, чувствительной камеры и шума ослабляется TIRF микроскопии флуоресценции одиночных флуорофоров можно легко проследить с течением времени. Похожие верно для обнаружения межмолекулярных событий smFRET. Тем не менее, осложнения могут быть вызваны FRET доноров bleedthrough и поперечным возбуждением FRET акцептором, и, таким образом большое внимание должно быть принято при регулировке плотности флуорофора в эксперименте smFRET.
В протоколе приводится ниже (раздел 4) протокол ТКС был выбран в качестве FRET донора в высокой численности и рМНС как FRET акцептором в низкой численности. Для ослабления FRET донор bleedthrough достаточно, украсить 10-30% от ТКР с люминесцентным SCF V и 90-70% от ТКР с нефлуоресцентного SCF V. Здесь акцептор FRET канала было выбрано в качестве канала единичных молекул, поскольку это конфокальной с одной молекулой FRET канал. Это помогает выровнять события smFRET с одной молекулы FRET акцепторов, которая является основой проверки smFRET.
Извлечение синаптические отходящих цены путем измерения smFRET
Фотообесцвечивание обоих FRET донора и акцептора FRET должны быть учтены при извлечении полураспада взаимодействия с одной молекулы FRET следы. На начало их появления в одной паре донор-акцепторного N число наблюдаемых лобзики сигналов (0) уменьшается в течение долгого времени и развязывание рецептор-лиганд и фотообесцвечивания. Число выживших комплексы в данный момент времени N (T) может быть математически выражена следующим образом:
<p clasS = "jove_content">В перспективе фотообесцвечивание ехр (-t / τ) отбеливателя время т описывается произведением числа наблюдений п и освещения времени Т жестокого из-за непостоянной, дискретном режиме наблюдения (т.е. отбеливания происходит только во время освещения ). В кинетической срок exp- (т / τ от) время т является произведением числа наблюдений п и время задержки т для одного наблюдения FRET (т.е., кинетическая развязывание происходит непрерывно). Уравнение 1 может быть выражена как:
Термин τ отбеливатель / τ плохо дешенных толстых число наблюдений пока не происходит отбеливание и определяется как среднее значение <п отбелить> его экспоненциальной функции. Уравнение 2 может быть упрощена следующим образом:
Среднее значение <п (т отставание)> числа кадров N (T) с наблюдаемыми лобзики событий после времени Т определяется непосредственно из эксперимента. Это зависит от устанавливаемого времени между наблюдениями (т отставание), выбранных в эксперименте и неизвестных значений т выкл (обратной офф-скорости K ВЫКЛ) и <п отбелить>, среднее значение количества наблюдений, прежде чем происходит отбеливание ,
Таким образом, расчет среднего значения <п (т)> лаг, по крайней мере двух значений т <sub> задержка позволяет экспериментально определить <п отбелить> и Т от.
Извлечение синаптические значения 2D-К D путем измерения FRET основе
Измерение TCR заполняемость а, т соотношение между связанными ТКО и общего ТКО, занимает центральное место в определении значения синаптических 2D-К D. В соответствии с уравнением 4 этот термин прямо пропорциональна измеренной FRET выход тех пор, как ТКО служит FRET доноров и акцепторов, как pMHCs ладу.
с размещение = TCR, С = коэффициент преобразования
С является константой, зависит от системы рвать и флуорофоры используется. Это может быть определено экспериментально, как показано ниже. а может быть преобразован в 2D-K D в соответствии с уравнением 5, когданачальная плотность TCR лиганды перед добавлением Т-клеток в бислой известно. Это происходит из-за высокой подвижности SLB-прикрепленных белков, а также потому, что SLBS обеспечить почти неисчерпаемого резервуара лигандов 2.
с [рМНС первоначального] = начальная плотность рМНС перед добавлением Т-клеток
С уравнений 4 и 5 теперь можно легко определить синаптической 2D-K D между TCR и рМНС. Это наиболее надежно сделано с измерениями FRET основе восстановления доноров после акцепторного отбеливания (см раздел протокола 3.1).
Тем не менее, для измерения C взаимосвязь между интенсивностью FRET я ладу (с поправкой на фоне, лада донор bleedthrough и FRET акцептором кросс-возбуждения) и ТКС размещение должен быть определен. Для этого, одиннужно знать отношение R между средней интенсивности флуоресценции одиночных ТКР, связанных FRET доноров флуорофорами (например Cy3 или AF555) см я FRET донора и средняя интенсивность одной молекулы FRET события см я ладу. R зависит от системы FRET идет речь, фильтры выбросов и камерой, используемой для регистрации флуоресценции.
ТКР размещение а, то может быть непосредственно определена в соответствии с уравнением 6.
с R = см я FRET доноров / см я ладу
R была определена как 1,45 для системы H57 scFv- Су3 / ПКИКЖ-Cy5 приводит к:
а = основная Я FRET / объемную я TCR-Су3 • 1,45
Взаимосвязь между размещение TCR а и выход FRET может быть определена путем FRET донора восстановитьг, после акцепторного отбеливания. Для этого оба параметра в заговоре против друг друга в течение ряда TCR микрокластеров, как показано на рисунке 4A .В наклона линейной подгонки указывает коэффициент преобразования C (из уравнения 4).
Как показано на фиг.4А, С составляет для (а) H57 SCF V – Cy3 / рМНС-Су5 системы FRET и (б) от приложенного конфигурации системы микроскопа 1,995. ТКР размещение а может быть легко вывести следующим образом:
Размещение ТКС а = FRET выход • 1,995
Измерение белок-белковых взаимодействий в месте весьма желательно, особенно при работе с низким сродством взаимодействия, таких как TCR-связывающий рМНС 11. Это потому, что на скорости, а также устойчивость таких взаимодействий значительной степени зависит от конкретных обстоятельств, при которых имеет место связывания. Таким образом, минимально инвазивные FRET подходы изображений в принципе идеально подходит для таких задач, но включать ряд препятствий, которые должны быть сначала преодолеть. Уровень шума сотовой флуоресценции ограничивает чувствительность измерений и, следовательно, должны быть сведены к минимуму. TIRF микроскопии служит эту потребность очень хорошо 12, но требует функционализации стеклянных слайдов, желательно в виде плоской стеклянной поддерживает липидный бислой украшенной белков выбора 13-15. Еще одно преимущество частично преобразовываю- подхода является то, что рекомбинантные двухслойные резидентом FRET партнеры могут быть намного мруды легко помечены в количественном, сайт-специфической и рационально с меньшими и более ярких флуорофорами чем было бы возможно с поверхностно-клеточных белков выражается. ТКО с тегами рекомбинантный SCF В с, что не влияет на признание Т-клеток, как было ранее испытания 2. Кроме того, состав белка в SLB, например плотность pMHCs и выбор вспомогательных факторов можно регулировать своих конкретных потребностей. Ранее мы уже провели эксперименты с различными плотности стимулирующих pMHCs, но не обнаружили существенных различий в 2D-K от 2D-и Уб 2.
Пока здесь признание молекул MHC класса II был нанесен лишь, главным образом из-за характера их пептидсвязывающий щели, которая открыта на обоих концах и, таким образом вмещает большие пептиды в том числе линкера для присоединения флуорофора. В некоторых случаях такой подход может также работать для маркировки МНС CLAсс я молекул 16, но с большой осторожностью должны быть приняты, чтобы проверить их использование в экспериментах. Чувствительность Т-клеток по отношению к антигенам, которые могут быть измерены с помощью пролиферации Т-клеток анализов, а также рМНС-TCR кинетики связывания, как измерено в пробирке с помощью поверхностного плазмонного резонанса не должны зависеть от того линкера и флуорофора пептид. Кроме того, МНС класса I молекул себя могут быть помечены в сайт-специфическим образом с введением непарным цистеина в последовательности тяжелой цепи (неопубликованные наблюдения).
С использованием соответствующих молекулярных зондов любой синаптической белок-белковое взаимодействие могут, в принципе, быть изучены в моде, описанной здесь. Такие зонды, например, SCF В с или Предназначен анкириновых Повторите Белки (белков DARP) 17, должны быть одновалентной и должны связывать свою цель стабильно, не затрагивая взаимодействие интересов. Конечно, структурная ИНФОРМАЦИЯп весьма желательно, рациональной конструкции зонда, но не абсолютно необходимо. При создании новой пары партнеров FRET, рекомендуется записывать и анализировать FRET оптом первым. Сайты привязанности этикетки может варьироваться значительно увеличить сигнал FRET, а также чтобы убедиться, что измеренные FRET доходность различаются в зависимости от расстояния меж- красителя. После того, как система оптимизирована, одна молекула FRET сигналы могут быть записаны путем ограничения маркировку высокого изобилия FRET партнера до 10-30%, а отбеливания низкой численности FRET партнера до тех пор, одиночные молекулы не разрешимы в области освещения.
Последнее, но не менее следует отметить, что SLBS приблизительно некоторые, но не все аспекты физиологической плазматической мембране. Такие качества, как мембранный кривизны и гибкости, домена компартментализацией, цитоскелета перестановок и подвижности клеток, а также высокой различных поверхностно-выражены мембранных белков не представлены SLBS но может влиять тон исследуемого процесса. Много усилий нужно будет вложено в создание методов визуализации, которые позволяют мониторинга белок-белковых взаимодействий с разрешением одной молекулы в физиологических синапсов, которые недоступны для визуализации TIRF.
The authors have nothing to disclose.
М. была поддержана Шредингера общении Австрийским научным фондом (FWF, J3086-B11) и благодарит Макса Планка общества на финансовую и административную поддержку. С. и И. Н. поддержали Венской науки и техники (КОС фонда, LS13-030).
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Sf900 II | Life Technologies | 10227402 | insect cell media for baculo virus production |
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) | Fisher Scientific | 10564038 | insect cell media for baculo virus expression |
Sf9 cells | Life Technologies | 11496-015 | cells for virus production and expansion |
High Five Cells | Life Technologies | B855-02 | cells for potein expression |
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Centramate System | Pall | protein concentartion from large volumes | |
Centramate cassette 10kDa cutoff | Pall | OS010T12 | protein concentartion from large volumes |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC900308 | protein concentartion |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC800308 | protein concentartion |
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL | EMD Millipore | 5123 | protein concentartion |
Äkta pure 25L | GE Healthcare | 29-0182-24 | protein purification |
Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | protein purification |
Superdex 75 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5174-01 | protein purification |
Mono Q 5/50GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | protein purification |
Ni Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-01 | protein purification |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
Gilson HPLC system | Gilson | purificationof fluorochrome-coupled peptides | |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size | Agilent | A6000250X212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
Gilson HPLC system | Gilson | purificationof fluorochrome-coupled peptides | |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size | Agilent | A6000250X212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Cy3 maleimide | GE Healthcare | PA23031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Cy5 maleimide | GE Healthcare | PA25031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20347 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Fura-2, AM, cell permeant | Life Technologies | F-1221 | calcium-sensitive dye for cell labeling |
dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 151874 | for dissolving fura-2 am |
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium | Fisher Scientific | 10225362 | imaging buffer |
PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
Bovine Serum Albumin lyophilized powder | Sigma Aldrich | A2153 | supplement for imaging buffer |
14-4-4S antibody | affimetrix eBioscience | 14-5980-81 | blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR) |
5 ml polypropylene round-bottom tube | Becton Dickinson | FALCON 352063 | |
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC30GV0S | |
Syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Life technologies | T-7279 | |
Microscope for fura-2-based calcium measurements | LEICA | DMI4000B | |
Microscope for (single molecule) FRET measurements | LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | |
planar supported lipid bilayers | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | ||
RPMI 1640, with L-Glutamine | Life Technologies | 11554416 | T-cell media |
non-essential amino acid 100X | Hyclone | SH30238.01 | T-cell media supplement |
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x | Life Technologies | 12000226 | T-cell media supplement |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | T-cell media supplement |
mouse interleukin-2 recombinant protein | BPS Bioscience | 90185-B | T-cell media supplement |
Research Grade Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | T-cell media supplement |
Origin (analysis program) | OrigenLab | http://www.originlab.com/ | non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag]) |