This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.
T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (µM range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.
的T细胞是如何识别抗原的一个更根本的了解,需要寻找合适的地方,那就是,T细胞和APC之间形成的免疫突触内。这里,分子结合动力学不仅受到所涉及但相互作用配偶固有的生化特性决定上取决于细胞参数,其包括蜂窝力,膜结构和膜蛋白之间的横向相互作用以及突触特定几何约束在很大程度上3。生物化学方法在分辨能力,因为它们必要涉及的突触膜中的至少一个的中断限制。基于这个原因,基于FRET的成像方法的开发是为了监测TCR结合于抗原pMHCs 2。这里的T细胞的装饰用重组和位点特异性标记的TCRβ反应性单链抗体片段(SCF V)和面对计划芳玻璃支持的脂质双层(SLBs中),其怀有MHC II型分子装载有荧光标记的抗原性肽,共刺激分子和粘附蛋白。染料标记的TCR和染料标记的pMHC导致FRET,它可以在体和单分子水平通过全内反射荧光(TIRF)显微镜进行监测突触之间的结合。
在本文中它被详细地说明了如何利用SLBs的用于测定T细胞突触,通过功能T细胞钙流测定法验证它们的完整性,进行FRET散装和带单分子灵敏度的测量,并分析所获得的数据。建议是提供给生产所需的双层功能化符合正常的蛋白质。有关双层形成并设置一个合适的TIRF显微镜请参阅公布背对背4的附加 公共接入朱庇特的出版物的更具体的信息。
帐篷“> SLBs的性质可官能的SLBs可以从含有两个脂质1-棕榈酰-2-油酰基-sn- gylcero -3-磷酸胆碱单层囊泡(SUV的)可以容易地生成(简称:POPC,90-99%)和1,2- dioleoyl- SN -甘油基-3 – {〔N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸]琥珀酰基}(简称:DGS NTA镍,1-10%)。 SUV的铺展在干净的载玻片,以形成一个连续的平面双层4。 DGS-NTA-Ni表面供应通过多组氨酸介导的复合形成与合成含NTA镍头组(图1A)到锚多组氨酸标记的蛋白。为稳定的缔合人们通常替换粘附蛋白,ICAM-1和共刺激分子B7-1与含12个组氨酸(ICAM-1-12H,B7-1 -12H)一个标签的天然跨膜结构域和胞质尾(图1B) 。的肽负载II类分子的IEķ包含两个膜包埋(α和β)的多肽链秒。两条链的跨膜/胞质域必须被替换为含有6个组氨酸的每个(IEķα6Hβ6H或IEķ-2x6H)的标签。作为替代,延长了α链与12组氨酸和离开的β链标记(引起的IEķα12Hβ0H或IEķ-12H)的胞外域产生了令人满意的结果(图1B)。
pMHCs的位点特异性标记
能够测量FRET收率转换成有意义的平衡结合常数,重要的是为了化学计量和位点特异性标记的pMHC。这可以通过加载到重组组氨酸标记的MHC II型分子2,5的肽结合裂隙的合成肽的化学标记来实现。为该肽包含T细胞表位作为瓦特的所有残ELL作为短C-末端接头(GGS),然后加入半胱氨酸(例如,在蛾细胞色素C(MCC)肽ANERADLIAYLKQATK- GGSC,连接体被标记为粗体)。此半胱氨酸是用来与使用马来酰亚胺染料衍生物的化学计量标记肽。此时应加倍小心被用于核查定量染料耦合到含有半胱氨酸的肽。 HPLC纯化的肽 – 染料加合物的建议,并已应遵循的电喷雾质谱。任何记录的质量相当于肽离析物(不含染料)反映不完整的标签。如果这是真的,高效液相色谱纯化肽应进行连续两轮染料标记,直到标签被认为是定量的。需要注意的是,应避免MALDI-TOF质谱法,因为这方法涉及激光辐射样品电离。这种治疗崩解所附敏感的荧光团前肽质量被读出,从而underrepre货物内度染料结合的。
细胞结合的TCR与使用单价单采购商寻找V片段间接尚未站点特定的标签
它仍然具有挑战性的附加染料与细胞活细胞表面相关蛋白以位点特异性方式。为了克服这一障碍的表面暴露的TCR,从TCRβ反应性单克隆抗体H57-197 2的基因单价单链形式(SCF V)已建成。这种抗体与TCR复合物的晶体结构允许合理设计的一个版本,其中,在靠近所述的MHC相关肽(其中对相应FRET伙伴染料附着)的C末端的丝氨酸残基取代一个半胱氨酸残基。这种突变的半胱氨酸然后用作受体染料缀合( 图2)。
方法来记录FRET
核苷酸“>批量FRET的值是最适合于验证所选间染料距离之间的关系,并FRET在此TCR-的pMHC测定结合系统2的效率。另外,本体的FRET测量表明突触TCR-的pMHC亲和力的定性和定量的差异(见下文和协议第3.2节)。各种方法定量FRET效率在文献6相继出台。在这篇文章中FRET是通过记录(一)供体恢复受体漂白后,并通过
(二)致敏FRET受体发射。
第一种方法(一)需要使用FRET受体可以很容易地光漂白,和一个供体,这是相当耐光的。此外,它保证了光漂白受体不再能够淬火的供体荧光的是重要的。作为同一检测通道(供体)用于定量,不校正因子的D无色差,必须考虑,这使得这一方法简单,可靠。然而,定量测量不能重复同一标本点和改变FRET不能记录随时间。避免因分子扩散或细胞运动快速漂白步骤的目的应该是为,最大限度地减少了第一FRET供体(受体漂白之前)和第二FRET供体的图像采集(FRET受体漂白后)之间通过的时间的效果。它是建议采用的FRET受体激发波长的强大的激光光源,以最小化照明和漂白次。
相反,在致敏FRET发射测量(B)的方法的FRET供体是兴奋和FRET受体的排放量在FRET受体通道被观察到。变化FRET受体信号可以被记录随着时间的推移,但FRET供体排放到红移受体通道(Termed bleedthrough),并通过供体激发FRET受体交叉激发必须准确地确定,并从记录的FRET受体通道中扣除。对于此相应FRET供体和受体的FRET图像必须在空间上对准。
检测单分子(SM)FRET事件
与使用的激光器作为激发源,一个灵敏的照相机和噪声衰减的TIRF显微镜单荧光团的荧光,可以很容易地追查随时间。类似是真正的分子间smFRET事件的检测。然而,并发症可通过FRET供体bleedthrough和交叉激发FRET受体引起的,因而非常小心先后在smFRET实验调整荧光密度时才能作出。
在下面提供的协议(协议第4部分)的T细胞受体被选为FRET供体中高丰度和的pMHC如FRET受体中低丰度。为了减轻FR的ET供体bleedthrough充分,装饰用荧光SCF V和与非荧光SCF V中的电阻温度系数的90-70%的TCR的10-30%。这里的FRET受体通道被选为单分子信道,因为它是共焦与单分子FRET通道。这有助于对齐smFRET事件与单个分子的FRET受体,它是smFRET验证的基础。
通过smFRET测量提取突触离速率
两者的光漂白FRET供体和受体的FRET必须占提取的从单分子的相互作用FRET痕迹半衰期时为。可观察到的FRET的信号在其外观为单一供体-受体对的N开头的编号(0)是由两个解除绑定的受体-配体复合物和漂白的随时间减小。在给定时间N(叔)尚存复合物的数量可以在数学上表示如下:
<p clasS =“jove_content”>在光漂白术语EXP(-t /τ 漂白剂)的时间t通过观测数 n的即照射过程中漂白只发生在产品和照明时间 t 生病由于非连续的,离散的观察模式(描述)。内动力学术语EXP-(吨/τ 关)的时间 t的观测数 n的乘积,时间t 滞后单个FRET观察(即,动力学解绑定连续发生)。等式1可以表示为:
术语τ 漂白剂 /τ 病 DES直到漂白发生,并且定义了它的指数函数的期望值<N 漂白 > cribes观测次数。公式2可以简化如下:
帧的数量N(t)能够以可观察FRET的事件的期望值的<n(吨滞后)>后时间 t是直接从实验确定。这取决于所选择的实验中观测( 吨滞后)和未知值τ 关(的离速率K掉的倒数)之间可设置的时间和的<n 漂白 >,观测数的期望值漂白发生之前。
因此,期望值<N(叔滞后)>在 t的至少两个值的计算<sub>滞后使得实验测定<N 漂白 >和 τ 关闭。
通过基于FRET的测量,提取突触2D-K D取值
测量TCR占用一个, 即 ,结合的TCR和TCR的总之间的比率,是中央的决定突触2D-K D取值 。根据等式4这个术语是成正比的测量FRET收率只要TCR的充当FRET供体和pMHCs作为FRET受体。
用= TCR入住,C =转换系数
C是常数 ,其取决于FRET的系统上和所使用的荧光团。它可以通过实验确定,如下所示。一个可以根据式(5)被转换成2D-K d出现的TCR配体之前,加入T细胞以双层的初始密度是已知的。这是因为SLB-连接蛋白的高流动性,也因为SLBs中提供配2的几乎取之不尽,用之不竭的水库。
与[ 初始的pMHC]在加入T细胞=的pMHC的初始密度
由于等式4和5中现在可以很容易地确定TCR和的pMHC之间的突触2D- 杀敌 。这是最可靠的完成基于受体漂白(见协议第3.1节)后,供体恢复FRET测量。
然而,为了测量C中的 FRET 强度 I FRET之间的关系(校正为背景,FRET供体bleedthrough和FRET受体交叉激发)和TCR占用一个已被确定。对于这一点,需要知道的单TCR相关FRET供体荧光团(例如Cy3标记或AF555)SM的平均荧光强度之间的比率R 我FRET供体和单分子的平均强度FRET事件SM 我FRET。 – [R取决于FRET系统有问题,排放过滤器和摄像头用于荧光检测的。
TCR的占用一个然后可以根据等式6来直接测定。
与R = SM我FRET供体 / SM我FRET
R的确定为1.45的H57 scFv-的Cy3 /的pMHC-Cy5的系统导致:
A =散装我FRET /散装我TCR-的Cy3•1.45
该TCR占用一个和FRET收益率之间的关系可以用FRET供体决定恢复受体漂白后的年。对于此两个参数绘制对彼此为一些TCR性微所示的线性拟合的图4A .The斜率指示转换因子 C(由方程4)。
这表现在图4A中,C量为(a)该H57 SCF v -输出的Cy3 /的pMHC-Cy5的FRET体系和(b)施加的显微镜系统配置到1.995。该TCR占用一个可以很容易地推断如下:
TCR占用一个= FRET产生•1.995
测量原位蛋白质-蛋白质相互作用是特别是当以低亲和力相互作用如TCR-的pMHC结合11处理高度期望的。这是因为,结合速率,以及这种相互作用的稳定性显著由特定的情况下使用结合发生的影响。微创基于FRET的成像方法,因此,原则完全适合于这样的任务,但涉及一个数字,首先必须克服的障碍。通过细胞自发荧光产生的噪音限制了测量的灵敏度,因此应保持在最低限度。 TIRF显微镜提供这种需要非常阱 12,但需要的玻璃载玻片的功能化,理想地在装饰有选择13-15中的蛋白质的平面玻璃支持的脂质双层的形式。的局部reconstitutive方法的另一个优点是,重组双层驻留FRET伙伴可以是多米矿石轻松标记的定量,特定地点,合理的方式与更小,更亮的荧光比可能与细胞表面表达的蛋白质。的TCR的标签用重组SCFνs的 ,其不影响T细胞识别,如先前2测试。此外,SLB的蛋白质组合物,例如pMHCs的密度和辅助因子的选择可以调整到一个人的具体需要。我们先前已经进行的实验用不同刺激pMHCs的密度,但并没有发现在2D-K掉和2D-K D 2显著差异。
到目前为止这里识别MHC II型分子的已经处理过只,主要是因为它们的肽结合裂,这是在两端开口的性质,因此可容纳较大的肽,包括连接体为荧光团附着。在某些情况下,这种方法可能也适用于标签MHC CLASS I类分子16,但十分慎重,应采取核实他们在实验中使用。 T细胞对抗原,其可通过T细胞增殖测定,以及所述的pMHC-TCR结合动力学通过表面等离子共振测定的在体外测定的灵敏度不应受到影响通过加入连接体和荧光团的肽。或者,MHC I类分子本身可以与重链(未发表意见)的序列内引入一个未配对的半胱氨酸的被标记以位点特异性方式。
与使用适当的分子探针任何突触蛋白质 – 蛋白质相互作用可以原则上进行研究本文所述的方式。这样的探针,例如,SCFνs的或设计的锚蛋白重复(DARPins)17,应该是一价,并应结合它们的靶稳定地在不影响感兴趣的相互作用。当然,结构information是合理的探针设计非常可取的,但不是绝对必需的。当建立一个新的一对FRET伙伴,建议来记录和第一散装分析FRET。标签附着位点可以变化很大最大化FRET信号和也以验证测量FRET收率不同根据间染料距离。一旦系统进行了优化,单分子FRET信号可以通过限制高丰FRET伴侣的标记至10-30%和漂白低丰度的FRET伙伴直到单分子是可解析在照明领域进行记录。
最后但并非最不重要的,应该指出的是,SLBs的近似一些但不是一个生理质膜的所有方面。品质,如膜曲率和灵活性,域条块,细胞骨架重排和细胞运动以及高的各种表面表达的膜蛋白不是由SLBs中表示的,但可能会影响吨他在调查过程中。将需要付出很大努力,出资设立的成像方式是允许监视与生理突触,未至的全内反射荧光成像单分子分辨率蛋白质 – 蛋白质相互作用。
The authors have nothing to disclose.
MA是由奥地利科学基金会(FWF,J3086-B11)和感谢的薛定谔奖学金马克斯 – 普朗克协会的财政和行政支持的支持。 GS和JH是由维也纳科技基金(WWTF,LS13-030)的支持。
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Sf900 II | Life Technologies | 10227402 | insect cell media for baculo virus production |
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) | Fisher Scientific | 10564038 | insect cell media for baculo virus expression |
Sf9 cells | Life Technologies | 11496-015 | cells for virus production and expansion |
High Five Cells | Life Technologies | B855-02 | cells for potein expression |
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Centramate System | Pall | protein concentartion from large volumes | |
Centramate cassette 10kDa cutoff | Pall | OS010T12 | protein concentartion from large volumes |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC900308 | protein concentartion |
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Äkta pure 25L | GE Healthcare | 29-0182-24 | protein purification |
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Cy5 maleimide | GE Healthcare | PA25031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
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Microscope for fura-2-based calcium measurements | LEICA | DMI4000B | |
Microscope for (single molecule) FRET measurements | LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | |
planar supported lipid bilayers | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | ||
RPMI 1640, with L-Glutamine | Life Technologies | 11554416 | T-cell media |
non-essential amino acid 100X | Hyclone | SH30238.01 | T-cell media supplement |
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Research Grade Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | T-cell media supplement |
Origin (analysis program) | OrigenLab | http://www.originlab.com/ | non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag]) |