This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.
T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (µM range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.
T 세포가 항원을 인식하는 방법의 근본적인 이해는 T 세포와 APC 사이에 형성된 면역 시냅스 내에서, 즉, 정확한 위치를 찾고 요구한다. 여기서, 분자 결합 동력학은 셀룰러 힘, 막 구조 및 막 단백질 사이의 측 방향 작용뿐만 아니라 시냅스 특정 기하학적 제약들을 포함하는 셀룰러 파라미터에 크게 의존하지만 관련된 상호 작용 파트너의 본질적인 생화학 적 특성에 의해 결정되지 않는다 3. 생화학 적 방법은 그들이 관련된 시냅스 막의 적어도 하나의 중단을 필요로 해상력으로 제한된다. 이러한 이유로 FRET 기반 이미징 방법은 항원 pMHCs 2 TCR의 결합을 모니터하기 위해 개발되었다. 여기에 T – 세포 재조합로 장식되어 및 사이트 특별히 TCRβ 반응 단일 사슬 항체 단편 (SCF의 V) 표시 및 계획에 직면 MHC 클래스 II 형광 표지 된 항원 펩티드와 함께로드 분자, 보조 자극 분자와 접착 단백질을 항구 AR 유리 지원 지질 이중층 (SLB 수). 시냅스는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경으로 벌크 및 단일 분자 수준에서 모니터링 할 수 있습니다 FRET의 염료 표지 TCR 및 염색 표지 pMHC 결과 사이의 바인딩.
이 문서는, T 세포에 시냅스를 분석하기위한 SLB 수를 이용하는 기능성 T 세포 칼슘 플럭스 분석을 통해 자신의 무결성을 검증하는 방법을 상세히 설명하고, 실시 대량으로 단일 분자 감도 측정 FRET 및 수집 된 데이터를 분석한다. 권장 사항은 이중층 작용에 필요한 제대로 닮아 단백질을 생산에게 제공됩니다. 이중층의 형성과 적절한 TIRF 현미경 (4)를 다시 다시 게시 추가 공용 액세스 조브 간행물을 참조하시기 바랍니다의 설치에 관한보다 구체적인 내용은.
십t "> SLB 수의 자연Functionalizable SLB 수 용이 두 지질 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 실 -Sn- gylcero -3- 포스 포 함유 단일 층 소포 (SUV의)로부터 생성 될 수있다 (단 : POPC, 90-99%) 및 1,2- dioleoyl- SN을 – 글리세로 -3 – {[N (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산] 석시} (단 : DGS-NTA 니켈 1-10 %). 깨끗한 유리 슬라이드에 도포 SUV와 인접한 평면 이중층 (4)을 형성한다. DGS-NTA-NI는 합성 NTA – 니켈 함유 헤드 그룹 (그림 1A)와 폴리 히스티딘 매개 복잡한 형성을 통해 폴리 히스티딘 태그가 단백질을 고정하는 역할을한다. 안정 협회 하나를 들어 일반적으로 접착 단백질 ICAM-1과 열두 히스티딘에게 (ICAM-1-12H, B7-1 -12H)를 포함하는 하나의 태그와 공동 자극 분자 B7-1의 기본 횡단 도메인 및 세포질 꼬리를 대체합니다 (그림 1B) . 펩티드 -로드 된 클래스 II 분자 IE에서 k 개의 임베디드 막 (α 및 β) 폴리 펩타이드 쇄를 포함의. 양쪽 사슬의 트랜스 / 세포질 도메인은 각 여섯 개의 히스티딘 (IE K α β 6H 6H 또는 IE 케이 -2x6H)를 포함하는 태그로 대체되어야한다. 다른 열두 히스티딘과 α-체인을 확장하고 태그가 지정되지 않은 (12H의 β의 0H 또는 IE의 케이 -12H α IE의 K 상승을주는) β-체인의 세포 외 도메인을 떠나으로 만족스러운 결과 (그림 1B)을 발생시킨다.
pMHCs의 사이트 별 라벨
그것은 의미있는 평형 결합 상수에 FRET 측정 수율을 변환 할 수하기 위해 화학 양 론적 및 사이트 구체적으로 pMHC 레이블을하는 것이 중요합니다. 이는 재조합 히스티딘 태그가 MHC 클래스 II 분자의 2,5- 펩타이드 결합 틈에로드 합성 펩티드의 화학적 라벨링함으로써 달성 될 수있다. 펩티드 w로서 T 세포 에피토프의 모든 잔기를 포함엘 시스테인 다음에 짧은 C- 말단 링커 (GGS)으로 (예를 들어 나방 시토크롬 C (MCC) 펩타이드 ANERADLIAYLKQATK- GGSC에서, 링커는 굵은 글씨로 표시되어 있습니다). 이 시스테인은 말레이 미드 염료 유도체를 이용하여 화학량 론적으로 펩티드 라벨을 사용한다. 이 점에서 각별한주의가 시스테인 함유 펩타이드 정량 염료 커플 링을 확인에 전념해야한다. 펩타이드 염료 부가의 HPLC 정제를 권장하고 전기 분무 이온화 질량 분석에 의해 따라야한다. (염료없이) 펩타이드 유리체에 해당하는 모든 기록 대중은 불완전한 라벨을 반영한다. 이것이 사실이라면 라벨이 양적 것으로 간주 될 때까지, HPLC 정제 펩타이드는 염료 라벨의 연속 라운드를 실시해야한다. 이 방법은 시료의 이온화를위한 레이저 방사선을 포함 같이 MALDI-TOF 질량 분광법은 피해야합니다. 펩티드 질량 따라서 underrepre 판독되기 전에 처리는 부착 성 형광을 붕괴 염료 결합의 변위량도.
가의 단일 체인 F V 조각의 사용과 셀 바인딩 TCR도의 간접 아직 사이트 별 라벨
아직 사이트 별 방식으로 살아있는 세포의 표면 관련 단백질을 세포하기 위해 염료를 부착 도전하고있다. 표면이 노출 된 TCR도 장애물을 극복하기 위해, 모노클로 날 항체 TCRβ -reactive H57-197 (2)의 유전자 발 가의 단일 쇄 버젼 (SCF V)를 구성하고있다. TCR과 착물이 항체의 결정 구조가 합리적으로 (대응 FRET 파트너 염료가 부착) MHC 관련 펩티드의 C 말단 가까이에있는 세린 잔기가 치환 된 버전을 설계 할 수있다 시스테인 잔류 물. 이 돌연변이 시스테인은 염료의 결합 (그림 2)에 대한 수용체 역할을한다.
방법론은 FRET을 기록하는
NT "> 벌크 FRET 값은 선택된 간 염료의 거리 사이의 관계를 확인하는 것이 가장 적합하며, 시스템 (2) 결합이 TCR-pMHC 측정 효율을 FRET. 또한, 벌크 FRET 측정은 시냅스 TCR-pMHC 유사성의 정량적 차이 (공개 아래 참조) 및 프로토콜 3.2. 문헌 6에 도입 된 FRET 효율을 정량화하기위한 다양한 접근 방법을.이 문서 FRET을 통해 기록에서(a) 도너 복구 셉터 표백 후, 비아
(b)는 FRET 수용체 방출을 증감.
첫 번째 방법 (A)은 용이하게 광 퇴색 될 수 FRET 수용체, 오히려 광 안정성이다 도너의 사용을 필요로한다. 또한 이는 광 퇴색 셉터 더이상 도너 형광 급냉 할 수없는 것을 보장하는 것이 중요하다. 같은 감지 채널 (기증자)를 정량에 사용되는 바와 같이, 어떤 보정 요인 없습니다D 더 색수차는이 방법론 간단하고 신뢰성을 렌더링하는 고려되어야 할 필요가 없습니다. 그러나, 정량적 측정이 동일한 표본 지점에서 반복 될 수없고 FRET의 변화는 시간에 기록 할 수 없다. (수용체 표백 전) 첫 번째 무서워 기증자와 (FRET 수용체 표백 후) 두 번째 FRET 공여 이미지 수집 사이를 통과하는 시간을 최소화 분자 확산 또는 빠른 표백 단계를 목적으로한다 세포 운동에 의해 발생 효과를 방지 할 수 있습니다. 그것은 조명 및 표백 시간을 최소화하기 위해 FRET 셉터 여진 파장의 강력한 레이저 광원을 사용하는 것이 권장된다.
반면, (b) 방출 민감화 FRET 측정 접근법 FRET 도너는 흥분과 FRET 수용체의 발광은 FRET 수용체 채널에서 관찰된다. FRET 수용체 신호의 변화가 적색 편이 수용체 채널로 시간 만 무서워 기증자의 방출을 통해 기록 할 수있다 (Termed bleedthrough) 정확하게 결정하고 기록 FRET 수용체 채널에서 공제 할 필요가 기증자 여기를 통해 수용체 크로스 여기를 FRET. 이를 위해 FRET 도너 대응하고 FRET 셉터 이미지 공간적으로 정렬되어야한다.
단일 분자 검출 (SM) 이벤트를 FRET
여기 원, 민감한 카메라와 노이즈 감쇠 TIRF 현미경으로서 레이저를 이용하여 하나의 형광체의 형광 쉽게 시간 동안 추적 될 수있다. 유사한 분자간 smFRET 이벤트의 검출을위한 사실이다. 그러나 합병증 FRET 도너 bleedthrough 및 FRET 수용체의 가교 자극에 의해 발생하고, 따라서 세심 smFRET 실험에서 형광 밀도를 조정할 때는주의가 필요하다 할 수있다.
아래의 프로토콜 (프로토콜 섹션 4)에서 TCR 낮은 풍부 FRET 수용체 높은 풍부하고 pMHC에 무서워 기증자로 선정되었다. FR을 감쇠충분히, 형광 SCF (V)과 비 형광 SCF의 V를 사용하여 TCR도의 90-70%와 TCR도 10-30 %에 장식 bleedthrough 동부 기증자. 그것은 하나의 분자와 공 초점이 채널을 FRET 때문에 여기 FRET 수용체 채널은 단일 분자 채널로 선택되었다. 이 smFRET 검증의 기초가 무서워 수용체 단일 분자와 smFRET 이벤트를 정렬하는 데 도움이됩니다.
smFRET 측정을 통해 시냅스 오프 비율을 추출
양자의 광표백은 도너와 억 셉터를 FRET는 단일 분자의 상호 작용이 트레이스를 FRET의 반감기를 추출 할 때 고려되어야 할 FRET. 단일 도너 – 억 셉터 페어로서의 외관 N의 시작-FRET 관찰 신호의 수 (0) 수용체 – 리간드 복합체의 양 및 광표백 바인딩 해제하여 시간이 지남에 따라 감소된다. 다음과 같이 주어진 시간 N (t)에서 단지 생존 수는 수학적으로 표현 될 수있다 :
<p clasS = "jove_content">광표백 용어 특급 (-t / τ 표백제)의 시간 t는 즉 표백 만 조명시 발생 관찰 수 (N)의 생성물 및 (인해 비 연속적, 불연속 관찰 모드의 병, 조명 시간 t에 의해 설명된다 ). 운동 기간 exp- (t / τ OFF) 시간 t가 관찰 수 (N)의 곱과 단일 FRET 관찰 (즉, 결합 해제 운동이 연속적으로 발생 함)에 대한 시간 t 래그 내이다. 수학 식 1과 같이 표현 될 수있다 :
용어 τ 표백제 / τ 아픈 데백화가 발생하고, 기대 값이 <N 백제>로서의 지수 함수 정의 될 때까지 관찰의 수를 cribes. 다음과 같이 수학 식 2를 단순화 할 수있다 :
시간 t-FRET 관찰 후 이벤트와 프레임의 수 N (t)의 기대 값은 <N (t 래그)> 직접 실험으로부터 결정된다. 이 실험에서 선택된 관측 (t 래그) 및 τ 오프 (OFF k는 오프 – 속도의 역수)에 대한 미지의 값의 설정 가능한 시간에 따라 표백이 발생하기 전에, 관측 횟수의 기대 값을 <N 백제> .
따라서, t의 적어도 두 값의 기대 값 <N (t 래그)>의 계산 <sub> 지연이 <N 표백> 오프 τ의 실험적인 결정을 할 수 있습니다.
FRET 기반의 측정을 통해 시냅스 2D-K D 값을 추출
TCR 점유 즉, 바인딩 TCR도 총 TCR도 사이의 비율을 측정, 시냅스 2D-K D의 값을 결정하는 핵심이다. 한 TCR도가 무서워 기증자와 pMHCs 무서워 수용체로의 역할로 산출 프렛 측정에 식 (4)에 따르면이 용어는 직접적으로 비례한다.
= TCR 점유율과, C는 = 환산 계수
C는 FRET 시스템에 의존하고 형광체가 사용되는 상수이다. 아래 그림과 같이이 실험적으로 결정될 수있다. 수학 식 5에있어서, 2D-K D로 전환 될 때종래 이중층에 T 세포의 첨가로 TCR 리간드의 초기 밀도가 공지되어있다. 이는 SLB 부착 단백질의 높은 이동성의 SLB 수이며, 또한 (2)의 리간드는 거의 무진장 저장조를 제공하기 때문이다.
[pMHC의 초기]는 종래의 T 세포에 첨가 pMHC의 초기 밀도를 함께 =
식 4, 5 일 지금 쉽게 TCR 및 pMHC 사이의 시냅스 2D-K D를 확인할 수 있습니다. 이것은 가장 확실 수용체 표백 (프로토콜 3.1 절 참조) 후 기증자의 회복을 기반으로 FRET 측정으로 이루어집니다.
그러나, C에게 내가 FRET FRET 세기 간의 관계를 측정하고 TCR 점유 결정한다 (배경에 대해 보정, FRET 도너 및 억 셉터 bleedthrough 교차 여진은 FRET). 이를 위해, 하나의내가 기증자를 FRET과 단일 분자의 평균 강도 사건이 난 FRET SM FRET 단일 TCR 관련 FRET 기증자 형광 (예를 Cy3 또는 AF555) SM의 평균 형광 강도의 비 (R)를 알 필요가있다. R은 형광 검출에 사용되는 질문, 배출 필터와 카메라의 FRET 체제에 따라 다릅니다.
TCR은 다음 직접 식 6에 따라 결정될 수있다 점유.
R = SM과 내가 FRET 기증자 / SM을 FRET
R은 리드 H57 scFv-를 Cy3 / pMHC-Cy5의 시스템에 대한 1.45로 하였다 :
= 대량 나는 1.45 • / 대량 나는 TCR-CY3을 FRET
TCR 점유 및 FRET 수율 사이의 관계는 FRET 공여체에 의해 결정될 수있다 복구수용체 표백 후 Y. 선형 피팅 그림 4A 국지적 인 슬로프에서와 같이이 두 매개 변수가 숫자 TCR의 microclusters에 대해 서로에 대해 플롯은 (식 4)에서 변환 계수 C를 나타냅니다.
1.995로는 Cy3 / Cy5의 pMHC-FRET 시스템 및 (b) 가해 현미경 시스템 구성 -도 4a에서 설명 된 바와 같이, C가 (a)의 V H57 SCF 대한 금액. TCR은 다음과 같이 용이하게 추론 될 수 점유 :
TCR 점유 = 1.995 • 산출 FRET
동일계에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 측정하는 것은 이러한 pMHC TCR-11 결합의 낮은 친 화성 상호 작용을 취급 할 때 특히 매우 바람직하다. 온 – 레이트뿐만 아니라 이러한 상호 작용의 안정성은 크게 결합이 일어나는 상황 하에서 특정의 영향 때문이다. 최소 침습 FRET 기반 이미징 방식 완벽 등의 작업에 적합하다 원리에 따라서, 제 아직 극복해야 할 장애물의 수를 포함한다. 자기 형광 세포에 의해 생성 된 잡음은 측정의 감도를 제한하고 따라서 최소한으로 유지되어야한다. TIRF 현미경 적으로 선택 13-15의 단백질과 장식 평면 유리 지원 지질 이중층의 형태로, 잘 (12)이 필요성을 제공하지만 유리 슬라이드의 작용을 필요로한다. 부분적 reconstitutive 접근법의 또 다른 장점은 재조합 이중층 상주 FRET 파트너 훨씬 m 될 수 있다는쉽게 작고 밝은 형광으로 양적, 사이트 별과 합리적인 방식으로 표시 광석 세포 표면 발현 된 단백질로 가능한 것보다. 이전에 2 테스트되었습니다로 TCR도는 재조합 SCF V S, T 세포의 인식에 영향을주지 않는 태그가 있습니다. 또한, SLB의 단백질 조성물은, 예를 들면 pMHCs의 밀도 및 액세서리 인자의 선택은 하나의 특정 요구에 조정될 수있다. 우리는 이전에 자극 pMHCs의 밀도 변화와 실험을 수행했지만, 오프 2D가-K 및 2D-K (D2)에서 유의 한 차이가 발견되지 않았다.
지금까지 여기 MHC 클래스 II 분자의 인식은 주로 때문에 양단이 개구들이 펩타이드 결합 틈의 특성으로 만 처리되었으며, 따라서 형광 물질을 부착하기위한 링커 펩티드를 포함 큰 수용한다. 어떤 경우에는 이러한 접근 방식은 또한 라벨의 MHC CIA 요원에 대한 작동하지 않을 수 있습니다SS 나는 16 분자하지만 큰주의는 실험에 사용을 확인하기 위해주의해야한다. 표면 플라즈몬 공진에 의해 시험 관내에서 측정 된 T 세포 증식 분석법뿐만 아니라 키네틱 결합 pMHC-TCR을 통해 측정 할 수있는 항원을 향해 T 세포의 감도는 링커 및 형광 물질에의 첨가에 의해 영향을 받아서는 안 펩티드. 또한, 내가 자신을 분자 MHC 클래스는 중쇄 (게시되지 않은 관찰)의 순서 내 짝 시스테인의 도입으로 사이트 별 방식으로 표시 할 수 있습니다.
적절한 분자 프로브를 이용하여 임의의 시냅스 단백질 – 단백질 상호 작용은 원칙적으로 본 명세서에 기재된 방법으로 연구 될 수있다. 예를 들어, 이러한 프로브는, SCF V의 또는 설계 Ankyrin 반복 단백질 (DARPins) (17)는 1가 있어야하며 관심의 상호 작용에 영향을주지 않고 안정적으로 자신의 목표를 결합해야합니다. 물론, 구조 informatio를N은 합리적인 프로브 설계에 매우 바람직하지만 절대적으로 필요합니다. FRET 파트너의 새로운 쌍을 설정할 때, 그것은 기록하고 처음으로 대량으로 FRET을 분석하는 것이 좋습니다. 라벨의 부착 위치는 FRET 신호를 최대화하기 위해 상당히 변화 될 수 있고 또한 수율이 FRET 측정 염료 간 거리에 따라 다를 수 있음을 확인하기 위해. 시스템이 최적화되면, 단일 분자는 신호 10-30%에 높은 풍부 FRET 파트너의 표시를 제한하고 단일 분자 조명 분야에서 분해 될 때까지 낮은 풍부 FRET 파트너 표백에 의해 기록 될 수있다 FRET.
마지막으로 그것이 SLB 수 어떤 근사하지만 주목해야하지 생리적 세포막의 모든 측면. 이러한 막 곡률과 유연성, 도메인 구획화, 세포 골격 재 배열 및 세포 운동성뿐만 아니라 표면 발현 막 단백질의 높은 다양한로서 자질 SLB 수로 표현되지 않고 T에 영향을 미칠 수그는 조사를 받고 처리합니다. 많은 노력이 TIRF 영상에 액세스 할 수없는 생리적 인 시냅스에서 단일 분자 해상도와 단백질 – 단백질 상호 작용을 모니터링 허용 영상 방식을 설정하는 데 투자해야합니다.
The authors have nothing to disclose.
석사 재정 및 행정 지원을위한 오스트리아 과학 기금 (FWF, J3086-B11) 및 감사의 슈뢰딩거의 교제 막스 플랑크 협회에 의해 지원되었다. GS와 JH는 비엔나 과학 기술 기금 (WWTF, LS13-030)에 의해 지원되었다.
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Sf900 II | Life Technologies | 10227402 | insect cell media for baculo virus production |
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) | Fisher Scientific | 10564038 | insect cell media for baculo virus expression |
Sf9 cells | Life Technologies | 11496-015 | cells for virus production and expansion |
High Five Cells | Life Technologies | B855-02 | cells for potein expression |
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Centramate System | Pall | protein concentartion from large volumes | |
Centramate cassette 10kDa cutoff | Pall | OS010T12 | protein concentartion from large volumes |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC900308 | protein concentartion |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC800308 | protein concentartion |
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL | EMD Millipore | 5123 | protein concentartion |
Äkta pure 25L | GE Healthcare | 29-0182-24 | protein purification |
Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | protein purification |
Superdex 75 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5174-01 | protein purification |
Mono Q 5/50GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | protein purification |
Ni Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-01 | protein purification |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
Gilson HPLC system | Gilson | purificationof fluorochrome-coupled peptides | |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size | Agilent | A6000250X212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
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Cy3 maleimide | GE Healthcare | PA23031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Cy5 maleimide | GE Healthcare | PA25031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20347 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
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TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Life technologies | T-7279 | |
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Microscope for (single molecule) FRET measurements | LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | |
planar supported lipid bilayers | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | ||
RPMI 1640, with L-Glutamine | Life Technologies | 11554416 | T-cell media |
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Research Grade Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | T-cell media supplement |
Origin (analysis program) | OrigenLab | http://www.originlab.com/ | non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag]) |