関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

すべての実験は、スタンフォード大学の人間の被験者のガイドラインに沿って行われ、治験審査委員会のプロトコルを承認しました。 1.関節軟骨細胞の単離人工膝関節全置換術の際に廃棄された組織から軟骨を取得し、以前に説明したように8解剖。 視覚滑らかな表面のための軟骨サンプルの内側または外側大腿骨顆を選択して、軟骨下骨に影響を与えることなく、4〜5ミリメ​​ートルの軟骨生検を除去するためにメスを介して軟骨の表面に切り込みを入れます。 精製されたコラゲナーゼでO / N処理と組織の酵素解離によって細胞外マトリックスから軟骨細胞を分離します。 37℃での軟骨細胞の増殖培地にコラゲナーゼII（125 U / ml）およびコラゲナーゼIV（160 U / ml）を1：1の比を使用してください。 翌日、70を介して分離した細胞を含む消化された組織をフィルタリングミリメートル孔径ナイロンメッシュ。 5分間600×gでDMEM / F12と遠心の20mlで2回洗浄します。 プレート10％ウシ胎児血清（FBS）、25 / mlのアスコルビン酸、2mM L-グルタミン、抗菌剤を補充したDMEM / F12中に再懸濁以下、1×10 6細胞 / 60mm培養ディッシュの密度で単離された軟骨細胞（100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および0.25 / mlのファンギゾン）。プレートを37℃で維持し、生体模倣ヒドロゲルでカプセル化の前に、高密度の単層としての一次軟骨細胞培養を維持します。 2.バイオミメティックハイドロゲルの作製注：この方法は、DPBS中で、ポリ（エチレングリコールジアクリレート）（PEGDA、MW 5,000グラム/モル）、コンドロイチン硫酸 – メタクリレート（CS-MA）を含有する生体模倣ヒドロゲルの合成を可能にします。光開始剤の添加は、光活性化架橋を可能にします。最終のヒドロゲル組成物は、7％の重さが含まれW / V CS-MAの3％、および重量/体積の光開始剤の0.05％、PEGDAの（w / v）のT /体積。 メタクリレート基でCSポリマーを官能することにより、CS-MAを合成します。 MESの1.952グラムおよび脱イオン水200ml中のNaClの5.84グラム（DIH 2 O）を溶解させて緩衝50mMの2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）の溶液及び0.5 M塩化ナトリウム（食塩）を準備します。緩衝液中のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩を5g溶解します。 （：EDC = 1：2 NHSのモル比）を0.532グラム（4.62ミリモル）のN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）および1.771グラム（9.24ミリモル）の1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル） – カルボジイミド塩酸塩（EDC）を加えます5分間溶液と、撹拌。 溶液を24時間、室温で反応を維持する（2：1：EDC：NHS AEMA = 1のモル比）0.765グラム（4.62ミリモル）の2-アミノエチルメタクリレート（AEMA）を加えます。 透析チューブ（12-14 kDaのMWCO）を使用して、4日間脱イオン水（DIH 2 O）に対する透析により混合物を精製します。 Pをフィルタリング0.22μmのフィルターを通してurified解決し、デシケーター、真空O / Nでの溶液を含むオープンチューブを配置します。すべてのチューブは、光から保護されていることを確認します。光と湿気から保護-20℃で溶解したポリマーを保管してください。 3.細胞のカプセル化 （セルを含んだ3Dハイドロゲルを打ち抜くための）PCRフィルムと円筒形ロッドをオートクレーブUV光の下で組織培養フードで0.2μmのフィルタ処理70％エタノールに浸漬して、カスタムメイドの円筒状のゲル型を滅菌します。 漏れを防止するために、気泡や隙間なくオートクレーブPCR膜とゲル型の底部を密封します。無菌の150mmプレートに保管してください。 前生体模倣ヒドロゲル中の細胞カプセル化する日は、コラゲナーゼIIおよびコラゲナーゼIV溶液中のO / N処理と高密度軟骨細胞単層を解離します。軟骨細胞の増殖培地に各コラゲナーゼIIおよびコラゲナーゼVI mlの160 U / 125 U / mlで使用37℃。 50 mlチューブに取り、5％重量/容積、ポリ（エチレングリコールジアクリレート）（PEGDA、MW = 5,000グラム/モル）（w / v）の3％重量/体積コンドロイチン硫酸 – メタクリレート（CS-MA）を追加し、そしてDPBS中のV光開始剤/ wの0.05％。溶液を混合し、それを脇に保つためにボルテックスチューブ。光からチューブを保護します。 50mlのファルコンチューブに解離した細胞を回収し、5分間460×gでカウントし、遠心します。吸引物は、すべてのセルチューブからメディア及び15×10 6細胞/ mlの密度で細胞を再懸濁するために上記混合ゲル材料を追加します。気泡の形成を回避しながら、徹底的に30回にそれを混ぜます。 ピペット72カスタムメイドの円筒状のゲル型に細胞ヒドロゲル懸濁液又は単独のヒドロゲルのμL、5分間3ミリワット/ m 2のUV光（波長365nm）への暴露によりゲル化を誘導します。無細胞内容のいくつかのヒドロゲル溶液を準備します。将来の生化学的および機械的試験のための陰性対照として、これらの構築物を使用してください。 Measu紫外線強度計でUV光の強度を再。強度を調整するには、UV光源とゲル中のヒドロゲル足場の間の距離を変更します。 注：ヒドロゲルは、CSが含まれているため、無細胞の寄与は細胞のGAGのみを表現するために、細胞を含んだヒドロゲルの生化学GAG含有量から差し引かれます。 オフイージーピール用のフィルムをカットするメスを使用して、慎重に取り外し。円筒状の棒の助けを借りて、未重合ゲルとゆるい細胞を洗い流し、無菌DPBS 5mlで6ウェルプレートにゲルを押し出します。 培養物を各ウェルに軟骨細胞増殖培地1.5 mlを含有する24ウェルプレート中の細胞を含んだハイドロゲル。ウェルに洗浄ヒドロゲルを転送するために使い捨てへらを使用してください。 生存性/細胞毒性キットを使ってライブ死んで染色後24時間カプセル化することによって、細胞の生存率を評価します。文化新鮮な軟骨細胞GROへの変更3-6週間のセルを含んだヒドロゲルおよび空のヒドロゲル2日ごとに解析のために回収する前にメディアWTH。 4. RNA抽出および遺伝子発現解析慎重にメディアを吸引し、細胞を含んだだけでなく、空の制御ヒドロゲルに滅菌PBS 1Xを置きます。 無菌のへらの助けを借りて、きれいな1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに各ヒドロゲルを転送し、各チューブにトライ試薬の250μlを添加します。 RNAを単離するために、メーカーの指示に従ってください。 各サンプルからのRNAの単離および定量化の使用後は、それを1μgと高容量cDNAを逆転写キットを用いてcDNAに逆転写を行います。 定量的PCRのために興味のある遺伝子の発現の検査のためのTaqMan遺伝子発現アレイを使用しています。 GAPDHの内部遺伝子発現レベルを正規化します。 PCR条件のために10に続くウラシルDNAグリコシラーゼを用いた以前のアンプリコンを、不活性化するために50℃で2分間のインキュベーションを含みます60; 95℃でのインキュベーションminのTaqポリメラーゼを活性化します。その後、95℃で15秒間からなる40サイクルのPCRを行い、60℃で1分間。 5.生化学分析各セルヒドロゲルの構築のためのDNAと以下のように硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）の生産を定量化します。 慎重にメディアを吸引し、細胞を含んだだけでなく、空の制御ヒドロゲルに滅菌PBS 1Xを置きます。空のチューブを計量し、ティッシュペーパーの上にブロッティングした後、内部にヒドロゲルを入れて、ヒドロゲルの重量または湿重量を記録します。 酵素消化のために別々の1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ中で-20℃で各ハイドロゲルを凍結し、後で（GAG用）（DNA用）ピコグリーンアッセイおよびジメチルメチレンブルーアッセイを実行するために、消化産物の一部を使用しています。 ヒドロゲルの酵素消化のためpapainase溶液を調製します。 まずナトリウムphosphatの7.1グラムを計量することによりPBEバッファを用意Eの二塩基性（ の Na 2 HPO 4）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（EDTA-2ナトリウム）を1.6g。 、のdH 2 O 500mlに溶解し、pHを6.5に調整し、0.22 mmのフィルターを介して精製した溶液を濾過します。 PBEバッファー20ml中のL-システインの0.035グラムを溶解します。溶液および滅菌パパイン酵素を100μlをフィルタリングします。 準備ができてアッセイを実施する場合には、-20°Cからチューブを取り、凍結されたヒドロゲルに準備パパイン溶液を300μlを添加します。乳鉢と乳棒を用いてゲルを粉砕し、モータ乳棒でよく混ぜます。 追加のパパイン溶液で500μlにボリュームを持参してください。対照ゲルと同じ手順を実行します。 16時間3,9、60℃でインキュベートします。消化されたヒドロゲルを含む溶液は、従って、DNAおよびGAGの定量のために使用することができます。標準以下の製造業者のPRとしてラムダファージDNAとのピコグリーンアッセイを用いてDNA含量を測定otocol。 1,9-ジメチルメチレンブルー（DMMB）標準10としてサメのコンドロイチン硫酸と色素結合アッセイを使用して硫酸化GAG含有量を定量化します。対応湿重量のために、GAGの量を分割することにより、GAGの内容を決定します。 6.機械的試験 10 Nロードセルを取り付けたインストロン5944試験システムを用いて、一軸圧縮試験を行います。 インビトロ培養の希望日後、細胞ヒドロゲル足場および無細胞制御ハイドロゲルの圧縮試験を行います。 RTでPBS浴中で標本を水没し、負荷条件の下で軟骨組織が ​​経験する生理学的な歪みは10〜20％であると報告されているので、15％の最大ひずみ11,12に1％のひずみ/秒の速度で圧縮します13,14。 三次多項式を用いたひずみ曲線と曲線フィット対ストレスを作成します。 COMPRを決定15％の歪み値でカーブフィット式から能格接線係数。