3D Hydrogel Ponteggi per articolare condrociti, Cultura e Cartilagine Generation

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dei soggetti Stanford University Umani e approvati protocollo Institutional Review Board. Isolamento 1. articolare di condrociti Ottenere la cartilagine da tessuti scartati durante protesi totale di ginocchio e sezionare come descritto in precedenza 8. Visivamente selezionare i condili femorali mediale o laterale di campioni di cartilagine per superfici lisce e rendere incisione alla superficie della cartilagine attraverso un bisturi per rimuovere 4-5 biopsie mm cartilagine senza influenzare l'osso subcondrale. Isolare condrociti dalla matrice extracellulare per dissociazione enzimatica del tessuto con il trattamento / N O con collagenasi purificata. Utilizzare rapporto 1: 1 di collagenasi II (125 U / ml) e Collagenasi IV (160 U / ml) in terreni di coltura di condrociti a 37 ° C. Il giorno seguente, filtrare il tessuto digerito contenente le cellule dissociate attraverso un 70mm pori maglie di dimensione nylon. Lavare due volte con 20 ml di DMEM / F12 e centrifugare a 600 xg per 5 min. Piastra le condrociti isolati ad una densità di 1 x 10 6 cellule / 60 mm piatto di coltura dopo risospensione in DMEM / F12 addizionato con 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 25 mg / ascorbato ml, 2 mM L-glutammina, antimicrobici (100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,25 mg / ml Fungizone). Conservare le piastre a 37 ° C e mantenere le colture di condrociti primari come un monostrato alta densità prima incapsulamento in idrogel biomimetici. 2. Biomimetic Hydrogel Fabrication NOTA: Questo metodo permette la sintesi di un idrogel biomimetico contenente poli (etilene glicol diacrilato) (PEGDA, MW 5000 g / mole), condroitin solfato-metacrilato (CS-MA) in DPBS. L'aggiunta di fotoiniziatore permette reticolazione fotoattivato. La composizione idrogel finale contiene il 7% pesaret / Volume (w / v) di PEGDA, 3% w / v di CS-MA, e 0,05% w / v di fotoiniziatore. Sintetizzare CS-MA per funzionalizzazione CS polimero con gruppi di metacrilato. Preparare la soluzione tampone di 50 mM di acido 2-morpholinoethanesulfonic (MES) e 0,5 M di cloruro di sodio (NaCl) sciogliendo 1,952 g di MES e 5,84 g di NaCl in 200 ml di acqua deionizzata (DIH 2 O). Sciogliere 5 g di sale di condroitin solfato sodico nella soluzione tamponata. Aggiungere 0,532 g (4,62 mmol) N-idrossisuccinimmide (NHS) e 1.771 g (9.24 mmol) 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) cloridrato -carbodiimide (EDC) (rapporto molare di NHS: EDC = 1: 2) a la soluzione e mescolare per 5 min. Aggiungere 0,765 g (4,62 mmol) metacrilato di 2-amminoetil (Aema) (rapporto molare di NHS: EDC: Aema = 1: 2: 1) alla soluzione e mantenere la reazione a temperatura ambiente per 24 ore. Purificare il composto con la dialisi contro acqua deionizzata (diH 2 O) per 4 giorni usando tubo di dialisi (12-14 kDa MWCO). Filtrare la purified soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e posizionare i tubi aperti contenenti la soluzione in un essiccatore sotto vuoto e O / N. Assicurarsi che tutti i tubi siano protetti dalla luce. Conservare il polimero sciolto a -20 ° C al riparo dalla luce e dall'umidità. Incapsulamento 3. cellulare Autoclave i film e cilindrici aste PCR (per punzonatura gli idrogel 3D cell-carico) e sterilizzare lo stampo gel cilindrica su misura per immersione in 0,2 micron filtrato etanolo al 70% in cappuccio coltura tissutale sotto raggi UV. Sigillare il fondo dello stampo gel con pellicola PCR autoclave senza bolle d'aria o lacune per impedire perdite. Tenerlo in una piastra sterile, 150 millimetri. Il giorno prima di incapsulamento delle cellule in idrogel biomimetica, dissociare il condrociti monostrato ad alta densità con trattamento O / N in Collagenase II e soluzione Collagenasi IV. Utilizzare 125 U / ml per Collagenasi II e 160 U / ml per Collagenasi VI ciascuno in crescita di condrociti dei mediaa 37 ° C. Dai tubo da 50 ml e si aggiungono 5% peso / volume (w / v) di poli (etilene glicol diacrilato) (PEGDA, MW = 5,000 g / mole), 3% w / v condroitin solfato-metacrilato (CS-MA), e 0.05% w / v fotoiniziatore in DPBS. Agitare la provetta per miscelare la soluzione e tenerlo da parte. Proteggere il tubo dalla luce. Raccogliere le cellule dissociate in un tubo Falcon da 50 ml, contare e centrifugare a 460 xg per 5 min. Aspirare tutti i media dal tubo cellule e aggiungere il materiale sopra il gel miscelato risospendere le cellule ad una densità di 15 × 10 6 cellule / ml. Mescolare 30 volte a fondo, evitando la formazione di bolle d'aria. Dispensare 72 ml di sospensione cellulare-idrogel o da soli idrogel nello stampo gel cilindrica su misura e indurre gelificazione attraverso l'esposizione alla luce UV (365 nm) a 3 mW / m 2 per 5 min. Preparare una soluzione idrogel senza contenuto della cella. Utilizzare questi costrutti come controlli negativi per il futuro i test biochimici e meccanici. Misure l'intensità della luce UV con un misuratore di intensità UV. Per regolare l'intensità, modificare la distanza tra la sorgente di luce UV e il ponteggio idrogel durante la gelificazione. NOTA: Dal momento che l'idrogel contiene CS, il contributo acellulare viene sottratto dal contenuto GAG biochimica degli idrogel cellulari carichi di rappresentare solo il GAG cellulare. Utilizzare un bisturi per tagliare il film per easy peel e rimuovere con cautela. Con l'aiuto delle aste cilindriche, spingere fuori il gel in una piastra ben 6 con 5 ml di DPBS sterili per lavare gel polimerizzato e cellule allentati. Culture idrogel cellulari carichi in piastre da 24 pozzetti contenenti 1,5 ml di terreni di crescita di condrociti in ogni pozzetto. Utilizzare una spatola monouso per trasferire i idrogel lavati nel pozzo. Valutare la vitalità cellulare del morto in diretta colorazione 24 ore post-incapsulamento utilizzando un kit di sopravvivenza / citotossicità. Cultura idrogel cellulari carichi e gli idrogeli vuote per 3-6 settimane che cambiano a gro chondrocyte freschiwth dei media ogni 2 giorni prima della raccolta per le analisi. 4. RNA Estrazione e Gene Expression analisi Aspirare accuratamente la memoria e poi PBS sterile 1X sulla cellula-carico nonché gli idrogeli controllo vuote. Con l'aiuto di una spatola sterile, trasferire ogni idrogel di clean 1,5 ml provetta Eppendorf e aggiungere 250 ml di Tri-reattivo ad ogni provetta. Seguire le istruzioni del produttore per isolare l'RNA. Dopo l'isolamento di RNA e quantificazione uso 1 mg di esso da ogni campione e di eseguire una trascrizione inversa in cDNA utilizzando l'alta capacità cDNA corredo d'inversione di trascrizione. Per PCR quantitativa utilizzare TaqMan array di espressione genica per l'esame dell'espressione di geni di interesse. Normalizzare i livelli di espressione genica internamente per GAPDH. Per le condizioni di PCR includere un 2 min di incubazione a 50 ° C per inattivare ampliconi precedenti con glicosilasi uracile-DNA, seguito da 1060; min di incubazione a 95 ° C per attivare la polimerasi Taq. Quindi eseguire cicli di PCR quaranta, costituito da 15 sec a 95 ° C, e 1 minuto a 60 ° C. 5. Analisi biochimiche Per ogni costruzioni cellulari-idrogel quantificare il DNA e glicosaminoglicani solfato (sGAG) la produzione come segue. Aspirare accuratamente la memoria e poi PBS sterile 1X sulla cellula-carico nonché gli idrogeli controllo vuote. Pesare un tubo vuoto e mettere l'idrogel all'interno dopo assorbente su carta velina e registrare il peso o il peso umido degli idrogel. Congelare ogni idrogel a -20 ° C in un tubo separato ml eppendorf 1.5 per digestione enzimatica e successivamente utilizzare una aliquota di prodotto digerita eseguire PicoGreen dosaggio (DNA) e dimetil-metilene assay blu (GAG). Preparare la soluzione papainase per digestione enzimatica degli idrogel. Per prima cosa preparate il buffer PBE pesando 7,1 g di sodio phosphate bibasico (Na 2 HPO 4) e 1,6 g di acido etilendiamminotetracetico disodico sale (EDTA-Na 2). Sciogliere in 500 ml di dH 2 O, regolare il pH a 6,5 e filtrare la soluzione purificata attraverso un filtro 0.22 mm. Sciogliere 0,035 g di L-cisteina in 20 ml di tampone PBE. Filtrare la soluzione e 100 ml di sterile papaina enzima. Al momento di eseguire saggi, prendere le provette da -20 ° C e aggiungere 300 microlitri della soluzione papaina pronto a idrogel congelati. Schiacciare il gel con un mortaio e pestello e mescolare bene con il pestello motore. Portare il volume a 500 ml con soluzione papaina aggiuntivo. Eseguire la stessa procedura per i gel di controllo. Incubare a 60 ° C per 16 ore 3,9. La soluzione contenente l'idrogel digerito può quindi utilizzato per il DNA e GAG ​​quantificazione. Misurare il contenuto di DNA con il saggio PicoGreen con Lambda fago DNA di serie seguente pr del produttoreotocol. Quantificare il contenuto solfato-GAG utilizzando il blu 1,9-metilmetilene (DMMB)-dye legame test con squalo condroitin solfato di serie 10. Determinare il contenuto di GAG dividendo l'importo di GAG per la corrispondente peso umido. 6. Prove meccaniche Eseguire prove di compressione non confinati usando un sistema di prova Instron 5944 dotato di una cella di carico di 10 N. Dopo i giorni desiderati di coltura in vitro, eseguire il test di compressione sull'impalcatura cellula-idrogel e gli idrogeli controllo acellulari. Immergere i campioni in un bagno PBS a temperatura ambiente e comprimere ad un tasso del 1% ceppo / sec per un ceppo massimo del 15% 11,12 dal momento che la sforzo fisico vissuta da tessuto cartilagineo sotto condizioni di carico è stato segnalato per essere 10-20% 13,14. Creare lo stress contro curve deformazione e la curva in forma con un terzo ordine un'equazione polinomiale. Determinare i compressive tangente modulo dalla curva equazione forma in valori di deformazione del 15%.