3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações dos sujeitos Stanford University Humanos e aprovado protocolo Institutional Review Board. 1. Articular condrócitos Isolamento Obter cartilagem a partir de tecido descartado durante artroplastia total do joelho e dissecar como descrito anteriormente 8. Visualmente seleccionar os côndilos femorais mediais ou laterais de amostras de cartilagem de superfícies lisas e fazer incisão na superfície da cartilagem por meio de um bisturi de forma a remover as biópsias 4-5 mm de cartilagem sem afectar o osso subcondral. Isolar condrócitos a partir da matriz extracelular por dissociação enzimática do tecido com tratamento / N O com colagenase purificados. Use proporção 1: 1 de colagenase II (125 U / ml) e a colagenase IV (160 U / mL) em meio de crescimento de condrócitos a 37 ° C. No dia seguinte, filtra-se o tecido digerido contendo as células dissociadas através de uma 70mm tamanho dos poros da malha de nylon. Lavar duas vezes com 20 ml de DMEM / F12 e centrifugar a 600 xg durante 5 min. Placa os condrócitos isoladas a uma densidade de 1 x 10 6 células / 60 mm prato de cultura a seguir re-suspensão em meio DMEM / F12 suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 25 ug / ascorbato mL, 2 mM de L-glutamina, antimicrobianos (100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,25 ug / ml de fungizona). Manter as placas a 37 ° C e manter as culturas de condrócitos primários como uma monocamada de alta densidade antes da encapsulação em hidrogéis biomiméticos. 2. Biomimético Hidrogel Fabrication NOTA: Este método permite a síntese de um hidrogel biomimética contendo poli (etileno-glicol diacrilato) (PEGDA, PM 5000 g / mol), sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA) em DPBS. A adição de foto-iniciador de reticulação permite fotoactivado. A composição de hidrogel final contém 7% pesart / volume (w / v) de PEGDA, 3% w / v de CS-MA, e 0,05% w / v do foto-iniciador. Sintetizar CS-MA por funcionalização polímero CS com grupos de metacrilato. Preparar uma solução tamponada de 50 mM de ácido 2-morpholinoethanesulfonic (MES) 0,5 M e cloreto de sódio (NaCl) por dissolução de 1,952 g de MES e 5,84 g de NaCl em 200 ml de água desionizada (DIH 2 O). Dissolve-se 5 g de sal de sulfato de condroitina de sódio na solução tamponada. Adicionar 0,532 g (4,62 mmol) de N-hidroxissuccinimida (NHS) e 1,771 g (9,24 mmol) de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) (proporção molar de NHS: EDC = 1: 2) para a solução e agita-se durante 5 min. Adicionar 0,765 g (4,62 mmol) de metacrilato de 2-aminoetilo (AEMA) (proporção molar de NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) à solução e manter a reacção à temperatura ambiente durante 24 h. Purifica-se a mistura através de diálise contra água desionizada (DIH 2 O) durante 4 dias, utilizando tubagem de diálise (MWCO de 12-14 kDa). Filtra-se a purified solução através de um filtro de 0,22 um e coloque os tubos abertos contendo a solução no exsicador de vácuo e S / N. Assegurar que todos os tubos são protegidas da luz. Armazenar o polímero dissolvido à temperatura de -20 ° C ao abrigo da luz e humidade. Encapsulation 3. celular Autoclave o filme e cilíndricas hastes de PCR (para perfurar os hidrogéis 3D de células-laden) e esterilizar o molde gel cilíndrico feito por encomenda por submersão em 0,2 m filtrada 70% de etanol em cultura de tecidos capô sob luz UV. Fecha-se o fundo do molde de gel com película de PCR autoclavado sem bolhas de ar ou aberturas para evitar a fuga. Mantê-lo em um estéril placa de 150 mm. O dia antes da encapsulação de células em hidrogel biomimética, dissociar a condrócitos de monocamada de alta densidade com tratamento / N O em colagenase II e solução de colagenase IV. Use 125 U / ml para a colagenase II e 160 U / ml de colagenase para cada VI em meios de crescimento de condrócitosa 37 ° C. Tomar um tubo de 50 ml e adicionam-se 5% em peso / volume (w / v) (diacrilato de etileno-glicol) poli (PEGDA, PM = 5.000 g / mol), 3% w / v de sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA), e 0,05% w / v fotoiniciador em DPBS. Vortex do tubo para misturar a solução e mantê-lo de lado. Proteger o tubo de luz. Recolher as células dissociadas num tubo Falcon de 50 ml, contar e centrifugar a 460 xg durante 5 min. Aspirar todo o material da tubo de células e adicionar o material de gel misturado acima para re-suspender as células a uma densidade de 15 x 10 6 células / ml. Misturá-lo 30 vezes completamente, evitando a formação de bolhas de ar. Pipetar 72 ul da suspensão de células de hidrogel ou hidrogel sozinho para dentro do molde de gel cilíndrico feito por encomenda e induzir a gelificação por exposição à luz UV (365 nm de comprimento de onda) a 3 mW / m 2 durante 5 min. Prepare alguma solução de hidrogel sem conteúdo celular. Use essas construções como controlos negativos para o futuro de testes bioquímicos e mecânica. Measure a intensidade da luz UV com um medidor de intensidade da radiação UV. Para ajustar a intensidade, alterar a distância entre a fonte de luz UV e o andaime hidrogel durante a gelificação. Observação: Uma vez que o hidrogel contém CS, a contribuição acelular é subtraído do conteúdo de GAG ​​bioquímica dos hidrogéis de células carregadas para representar apenas o GAG celular. Use um bisturi para cortar o filme para fácil peel off e com cuidado remova-o. Com a ajuda das hastes cilíndricas, empurrar para fora do gel para uma placa de 6 poços com 5 ml de DPBS estéril para lavar gel não polimerizado e células soltas. Cultura os hidrogéis de células carregadas em placas de 24 poços contendo 1,5 mL de meio de crescimento de condrócitos em cada poço. Usar uma espátula descartável para transferir os hidrogéis lavou no bem. Avaliar a viabilidade celular por mortos vivem coloração 24 horas pós-encapsulamento usando um kit de viabilidade / citotoxicidade. Cultura os hidrogéis de células-laden e os hidrogéis vazios para 3-6 semanas mudando para gro de condrócitos frescoswth mídia a cada 2 dias antes da colheita para as análises. 4. RNA Extração e Análise de Expressão Gênica Aspirar cuidadosamente a mídia e colocar estéril PBS 1X na célula-laden, bem como os hidrogéis de controle vazios. Com a ajuda de uma espátula estéril, transferir cada um hidrogel a um tubo eppendorf de 1,5 ml limpo e adicionar 250 ul de Tri-reagente a cada tubo. Siga as instruções do fabricante para isolar RNA. Após o isolamento de RNA e quantificação utilização de 1 ug de cada amostra que e efectuar uma transcrição invertida em ADNc utilizando o High Capacity cDNA Kit de Transcrição Reversa. Para PCR quantitativo usar TaqMan Gene Expression Arrays para exame da expressão de seus genes de interesse. Normalizar os níveis de expressão do gene de GAPDH internamente. Para as condições de PCR incluem a 2 min de incubação a 50 ° C para inactivar amplicões anteriores com glicosilase de uracilo de ADN, seguido por um 1060; min de incubação a 95 ° C para activar a polimerase de Taq. Em seguida, executar ciclos de PCR quarenta, que consistem de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. 5. As análises bioquímicas Para cada estruturas celulares de hidrogel quantificar DNA e glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) produção como acompanhamento. Aspirar cuidadosamente a mídia e colocar estéril PBS 1X na célula-laden, bem como os hidrogéis de controle vazios. Pesar um tubo vazio e colocar o hidrogel dentro após a secagem-lo em papel de seda e registrar o peso ou peso úmido dos hidrogéis. Congelar cada hidrogel à temperatura de -20 ° C em um tubo Eppendorf de 1,5 ml separado para a digestão enzimática e depois usar-se uma alíquota do produto digerido a executar ensaio de Picogreen (para o DNA) e dimetil-metileno ensaio de azul (por GAG). Preparar a solução de papainase por digestão enzimática dos hidrogéis. Primeiro prepare o tampão PBE por pesando 7,1 g de sódio phosphate dibico (Na 2 HPO 4) e 1,6 g do ácido etilenodiaminotetracético, sal dissódico (EDTA-Na2). Dissolver em 500 ml de dH 2 O, ajustar o pH para 6,5 e a solução purificada filtrar através de um filtro de 0,22 mm. Dissolve-se 0,035 g de L-cisteína em 20 ml de tampão de PBE. Filtra-se a solução e 100 ul de enzima papaína estéril. Quando estiver pronto para realizar os ensaios, levar os tubos de -20 ° C e adicionar 300 ul da solução de papaína pronto para os hidrogéis congelados. Esmagar o gel com um almofariz e pilão e misture bem com o pilão motor. Levar o volume para 500 ul com solução de papaína adicional. Realizar o mesmo procedimento para os geles de controlo. Incubar a 60 ° C durante 16 horas 3,9. A solução contendo o hidrogel pode digerido por conseguinte, utilizados para quantificação de ADN e de GAG. Medir o teor de ADN, utilizando o ensaio de Picogreen com fago lambda de ADN como padrão seguinte PR do fabricanteotocol. Quantificar o conteúdo sulfatada-GAG utilizando o azul 1,9-dimetilmetileno (DMMB) ensaio de ligação de corante com sulfato de condroitina tubarão como padrão 10. Determinar o teor de GAG ​​dividindo-se a quantidade de GAG ​​para o peso húmido correspondente. 6. Ensaios Mecânicos Realizar ensaios de compressão simples, utilizando um Instron 5944 sistema de testes equipada com uma célula de carga de 10 N. Depois dos dias desejados de cultura in vitro, execute o teste de compressão no cadafalso célula-hidrogel e os hidrogéis de controle acelular. Submergir as amostras em um banho de PBS à temperatura ambiente e comprimir a uma taxa de 1% de deformação / seg para uma tensão máxima de 15% 11,12 desde o esforço fisiológico experimentado por tecido de cartilagem sob condições de carga tem sido relatada como sendo de 10-20% 13,14. Criar estresse vs. curvas de tensão e ajuste de curva usando uma equação polinomial de terceira ordem. Determinar os comprmódulo tangente essive partir da curva de ajuste equação em valores de deformação de 15%.