Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.
Tüberküloz (TB) hala tüm dünyada insanların sağlığı için büyük bir tehdit tutar ve bize yeni tedavi seçeneklerinin keşifler hastalık mekanizmalarını anlamak ve ilerletmek yardımcı olmak için düşük maliyetli ama güvenilir modelleri için bir ihtiyaç vardır. Mono tabakaları In vitro hücre kültürleri ya da ko-kültürler üç boyutlu (3D) bir ortam ve doku tepkileri yoksundur. Bu yazıda, Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) ile enfeksiyon sırasında meydana gelen karmaşık olayları incelemek için etkili bir araç olarak umut vaat insan akciğer dokusu, in vitro model yenilikçi açıklar. 3D doku modeli gözenekli bir zar üzerine kolajen matrisi içinde kültürlenir dokuya özgü epitel hücreleri ve fibroblastlar, oluşur. Hava maruziyet üzerine, epitel hücreleri tabakalandırmak ve apikal tarafında mukus salgılar. Insan birincil makrofajlar tanıştırarak M. ile enfekte Doku moduna tüberkülozl, immün hücreleri enfekte doku içine göç ve TBC granülom erken aşamalarında meydana göstermiştir. Bu yapılar temelde farklı veya sık yaygın olarak kullanılan deneysel hayvan modellerinde gözlenen değil, insan TB, granülom, ayrı özelliği özetlemek. Bu Organotipik kültür yöntemi konak hücre-patojen etkileşimleri mekansal ve zamansal özellikleri önemli bilgi sağlar 3 boyutlu görselleştirme ve sağlam nicel analiz sağlar. Birlikte ele alındığında, akciğer doku modeli TB çalışmaları için fizyolojik ilgili doku mikro ortam sağlar. Böylece, akciğer doku modeli temel mekanik ve uygulamalı çalışmalar hem de potansiyel etkileri vardır. Önemli olarak, model, böylece akciğerleri etkileyen enfeksiyon hastalıklarının çeşitli modellemek için kullanımını genişler tek tek hücre tiplerinde, ilave ya da manipülasyon.
İnsanlarda, enfeksiyon, doku iltihabı, hücresel işe alım, doku yeniden ve doku homeostazının düzenlemeye tepkiler farklı hücre tiplerini içeren karmaşık olaylardır. Dolayısıyla, bu süreçler en iyi lokal doku ortamında incelenir. Daha önce, bu çoğunlukla deneysel hayvan modelleri kullanılarak mümkün olmuştur. Genellikle insanlarda daha farklı bir şekilde patojenlere karşı cevap verir ve aynı zamanda hastalığın 1 farklı bir yol göstermek Ancak, yaygın olarak kullanılan deney hayvanları birçok sınırları tutun. In vitro akciğer dokusunda modelinde Bir insan, insan akciğerinde spesifik immün yanıtları incelemek için olasılıkları tutar.
İnsan tüberküloz enfeksiyonu (TB). Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), TB etkeni bakteriler akciğer dendri tarafından yuttu alveoler alana, taşınır aerosol damlacıkları yoluyla akciğere ulaşır akciğerleri etkileyen bir hastalıktırtik hücreleri ve enfeksiyon 2,3 doğuştan gelen bağışıklık yanıtının bir parçası olarak alveolar makrofajlar. Patojenin Fagositoz bir fagozomun içinde hata bölümlendirme yol açar ve ideal phagocyte ile nötralizasyon ve patojenin öldürülmesi ile sonuçlanır. M. maruz kalan bireylerin% 50 kadar tuberculosis tabii immun cevabın 4 ile enfeksiyonu temizleyebileceğine mümkün olduğuna inanılmaktadır. Diğer enfeksiyon sonuçların bir sonraki aşamada, latent enfeksiyon ya da en kötü durumda, kronik aktif hastalık 5 adaptif bağışıklık sistemi tarafından açıklık vardır.
Daha önce, insan TBC çalışmalar için bir in vitro doku modelleri olmuştur. Insan makrofajları ve diğer periferal kan hücrelerinin tekli hücre kültürleri, genellikle 6,7 kullanılmıştır. Bu yaklaşımın dezavantajı, M. maruz kalan akciğer dokusu içinde birlikte çalışan farklı hücre tiplerinin dinamiklerini yansıtmıyor olmasıdır tüberküloz </em>. Bu nedenle, TB ve işlevsel mekanistik çalışmalar yapabilmek için bir in vitro model için bir ihtiyaç vardır. Hücre tabanlı Burada anlatılan in vitro insan akciğer dokusu modelinde orijinal dendritik hücre fonksiyonları 8 çalışmalar için bizim grup tarafından kurulmuştur. Biz TB çalışması için bu yöntemi adapte var.
Burada sunulan insan akciğer dokusu modeli dokuya özgü epitel hücreler ve fibroblastlar 8 oluşur. Bu hücreler, bir Transwell ek ve normal insan akciğer dokusu (Şekil 1) benzer bir şekilde yapılarında gözenekli bir zar üzerine kolajen matrisi içinde kültürlenir. Hava maruz kaldığında hücreler apikal tarafında 8'de mukus salgılamaya başlar. Insan birincil makrofajlar implante tarafından M ile enfekte bağışıklık hücreleri dokuda göç ve TB granülom 9 erken aşamalarında formu nasıl modele tüberküloz, biz gözlemledik. Bu ilk insan dokusu modeli descri olduğunuTB IBED ve TB ve akciğer ve diğer hastalıklara karşı doğal immün yanıtları çalışmak için gelecek vaat eden bir araç teşkil etmektedir. Bugüne kadar, modelinde bağışıklık hücreleri sadece olarak monositleri ve makrofajlan kullanılan ama karmaşıklık düzeyi ilgili ek hücre tipleri dahil edilmesi ile artırılabilir.
Akciğer dokusu modelinin 1. şematik anahat rakam. (A) bir model M., insan akciğer epitel hücrelerine özgü oluşmaktadır tüberküloz primer makrofajlar ile enfekte ve kırmızı boya etiketli monositler bir transwell filtre üzerinde hazırlanan kollajen gömülü fibroblastlar üzerine numaralı seribaşı. Havaya doku modeli Pozlama epitel ile hücre dışı matriks proteinlerin üretimini, mukus salgılanmasını ve tabakalaşma başlatır. Böylece geliştirilen 3D doku modeli M. incelemek için yararlı bir araçtır clo bir ortamda tuberculosis enfeksiyonuyapt klar insan akciğeri. (B) bir doku modeli hazırlanmasında farklı adımların Örnek mikroskopik ve görüntüler. (C) akciğer modeli, doku bölümünün komple yapı benzemektedir. Ölçek -. 100 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination.
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9.
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions.
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11.
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Linköping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.
Cell culture inserts | BD Falcon | 353092 | |
6-well culture plates | BD Falcon | 353046 | |
MRC-5 cells, lung fibroblasts | ATCC#CCL-171 | ||
16HBE cells, lung epithelial cells | Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA | ||
5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM) | Gibco | 12800-082 | Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 µm filter. |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with glucose (DMEM) 1x | Gibco | 41965-039 | |
Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle’s salts | Sigma | M4655 | |
Non-Essential Amino Acids Solution, 100x | Life Technologies | 11140-035 | |
L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-024 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
NaHCO3 (71.2 mg/ml) | Prepared in house | ||
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Heat inactivated for 30 min, 56 °C |
Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-060 | |
Hepes buffer solution 1M | Gibco | 15630-056 | |
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco | 15140-122 | |
Lymphoprep | Axis-Shield | 7801 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA | Gibco | 15575 | |
Bovine Collagen PA treated (500 ml) | Organogenesis | 200-055 | |
Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml) | Advanced biomatrix | 5005-B | |
Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg) | BD | 354008 | |
Primary human monocytes/macrophages | Isolated from human whole blood or buffy coats. | ||
PKH26 Red fluorescent cell linker | Sigma | MINI26 | |
Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein | M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP. | ||
Middlebrook 7H9 medium | Difco | 271310 | |
BBL Middlebrook ADC Enrichment | BBL | 211887 | |
Tween-80 | |||
Glycerol | |||
Kanamycin B sulfate (20 µg/ml) | Sigma | B5264 | |
Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Trypsin -EDTA | |||
Bovine serum albumin | |||
Paraformaldehyde | |||
DAPI | |||
LSM700 Confocal microscope | Zeiss | ||
iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8 | Bitplane AG |