A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Clara Braian; Mattias Svensson; Susanna Brighenti; Maria Lerm; Venkata R. Parasa

doi:10.3791/53084

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunology and Infection

3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по Микобактерии туберкулеза Инфекция

Published: October 05, 2015

doi:

10.3791/53084

Clara Braian¹, Mattias Svensson², Susanna Brighenti², Maria Lerm¹, Venkata R. Parasa^1,2

¹Department of Clinical and Experimental Medicine,Linköping University, ²Department of Medicine,Karolinska Institute

Summary

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Abstract

Туберкулез (ТБ) по-прежнему имеет серьезную угрозу для здоровья людей во всем мире, и существует необходимость для экономичных, но надежных моделей, чтобы помочь нам понять механизмы заболевания и продвигать открытия новых вариантов лечения. В пробирке клеточных культур монослоев или со-культуры не хватает трехмерной (3D) окружающей среды и ответов ткани. Здесь мы опишем инновационный в пробирке модель человеческого легочной ткани, которая держит обещание, чтобы быть эффективным инструментом для изучения сложных событий, которые происходят во время инфекции с туберкулезом (Mycobacterium туберкулеза М.). Модель 3D ткань состоит из ткане-специфических эпителиальных клеток и фибробластов, которые культивировали в матрице коллагена в верхней части пористой мембраны. Под воздействием воздуха, эпителиальные клетки наслаиваются и выделяют слизь на апикальной стороне. Вводя первичных макрофагов человека заражены М. туберкулез в режиме тканил, мы показали, что иммунные клетки мигрируют в инфицированной ткани-и образуют ранние этапы гранулемы туберкулеза. Эти структуры воспроизводят Отличительной чертой человеческого туберкулеза, гранулемы, которая принципиально отличается или нет, обычно наблюдается в широко используемых экспериментальных животных моделях. Этот метод позволяет органотипической культура визуализации 3D и надежную количественный анализ, который обеспечивает основную информацию о пространственных и временных характеристик клеток-патоген взаимодействий принимающих. Взятые вместе, модель легочной ткани обеспечивает физиологически соответствующую тканях микро-среды для исследований по ТБ. Таким образом, модель легочной ткани имеет потенциальные последствия для обеих основных механистической и прикладных исследований. Важно отметить, что модель позволяет добавлять или манипуляции отдельных типов клеток, которые, таким образом, расширяет его использование для моделирования различных инфекционных заболеваний, которые влияют на легкие.

Introduction

В людях, ответы на инфекции, воспаление тканей, клеточной найма, ремоделирования ткани и регуляции гомеостаза тканей являются сложными мероприятия с участием различных типов клеток. Следовательно, эти процессы лучше всего изучать в локальной среде ткани. Ранее это было возможно, главным образом, с использованием экспериментальных моделей на животных. Однако широко используемые экспериментальные животные провести много ограничений, поскольку они часто отвечают на патогенов по-разному, чем люди, а также отображать различные течения заболевания ^1. У человека в пробирке модель легочной ткани имеет возможности изучать специфические иммунные реакции в легких человека.

Заражение человека туберкулезом (ТБ) в основном заболевание, поражающее легкие. Микобактерии туберкулеза (микобактерии туберкулеза), возбудитель туберкулеза, достигает легких через аэрозольных капель, которые транспортируются к альвеолярной пространства, где бактерии охвачен легких dendriтик клетки и альвеолярные макрофаги как часть врожденной иммунной реакции на инфекцию. ^2,3 Фагоцитоз возбудителя приводит к разобщенности ошибка в пределах фагосомы и идеально приводит к нейтрализации и убийства возбудителя по фагоцита. До 50% лиц, подвергшихся М. туберкулез, как полагают, чтобы иметь возможность очистить инфекции через врожденного иммунного ответа ^4. Другие результаты инфекции оформление по адаптивной иммунной системы на более позднем этапе, латентной инфекции или в худших случаях хронический активный болезнь ^5.

Раньше не было никаких моделей тканей в пробирке для исследования человеческого туберкулеза. Одиночные клеточные культуры человеческих макрофагов, или других клеток периферической крови часто использовались ^6,7. Недостатком этого подхода является то, что они не могут отражать динамику различных типов клеток, работающих вместе в легочной ткани воздействия M. туберкулез </eм>. Таким образом, существует потребность в модели ин витро, чтобы иметь возможность выполнять функциональные и механистических исследований на ТБ. Ячейка основе в пробирке модель человеческого легочной ткани, описанной здесь первоначально был создан в нашей группе по изучению дендритных клеточных функций ^8. Мы адаптировали этот метод для исследования туберкулеза.

Модель человеческого легочной ткани, представленные здесь состоит из ткане-специфических эпителиальных клеток и фибробластов ^8. Эти клетки культивируют в матрице коллагена в верхней части пористую мембрану в Transwell вставки и формы структуры, напоминающие нормальную человеческую ткань легких (рисунок 1). При соприкосновении с воздухом клетки начинают вырабатывать слизь в апикальной стороне ^8. По имплантации первичных макрофагов человека заражены М. туберкулез модели, мы наблюдали, как иммунные клетки мигрируют в ткани и образуют ранние этапы гранулем туберкулеза ^9. Это первый человек модель ткани DESCRibed туберкулеза и представляет многообещающую инструмент для изучения врожденных иммунных ответов на ТБ и других заболеваний легких. На сегодняшний день, мы использовали только моноциты и макрофаги, как иммунные клетки в модели, но уровень сложности может быть увеличена путем включения соответствующих дополнительных типов клеток.

Рисунок 1. Схема очертания модели легочной ткани. (А) Модель состоит из легких конкретных эпителиальных клеток человека, М. туберкулез -infected первичных макрофагов и красный краситель, помеченные моноциты высевают на коллагеновых встроенные фибробластов, полученных на Transwell фильтра. Воздействие на модели ткани на воздухе инициирует производство внеклеточных матричных белков, секрецию слизи и стратификации эпителием. Модель 3D ткани, таким образом, разработаны является полезным инструментом для изучения М. инфекции туберкулеза в окружающую среду, что ССНСэли напоминает человеческую легких. (B) Типичные микроскопических изображений на различных этапах подготовки модели ткани. (С) Полная структура раздела модели легочной ткани. Масштаб -. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

Примечание: периферической крови человека от здоровых доноров крови анонимных приобретенных в банке крови Linköping University Hospital, Швеция использовали в качестве источника иммунных клеток для этого исследования. Этот протокол предназначен для 24 мм 6-луночных пластин пластины. Прямая адаптация к другим форматам также не рекомендуется, поскольку модели ткани контрактов по вертикали и горизонтали в процессе разработки. 1. Подготовка материалов, средств массовой информации и культуры бактерий / клеточных линиях Культура бактерий: Растут микобактерий M. напряжение туберкулез H37Rv несущий плазмиду pFPV2 чтобы конститутивно экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP), в Миддлбрука 7H9 среде, содержащей 0,05% Tween-80, 0,5% глицерина, канамицин (20 мкг / мл), и с добавлением Миддлбрука альбумин, декстроза и каталазы обогащения ( Миддлбрук АЦП Обогащение), при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 7-10 дней. Примечание: все экспериментальные шагс участием живой яростную М. штаммы туберкулеза должны быть выполнены в BSL-3 объекте. Подготовьте Modified Игла среде (DMEM), полной среды 1x Дульбекко (с добавлением 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ HEPES, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 10 % инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS)). Подготовьте также антибиотик без DMEM полной среде. Приготовьте 1х минимальная поддерживающая среда (MEM) полной среды (1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ HEPES, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 10% тепло- инактивированной фетальной бычьей сыворотки (ФБС)). Приготовление фибронектина / коллаген покрытием колбы (всего 10 мл): Пипетка 8,8 мл стерильной 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), в чистую пробирку. Добавить 1 мл бычьего сывороточного альбумина (1 мг / мл), 100 мкл тип I бычьего коллагена (3 мг / мл) и 100 мкл рекомбинантного хуЧеловек фибронектин (1 мг / мл). Смешайте раствор, повернув трубку вверх-вниз 5 раз. Колбы покрывают раствором фибронектина / коллагена (1 мл на Т-25 и 2 мл для Т-75 колбу). Оставьте его O / N на 37 ° C. После инкубации удалить раствор и хранить колбы, покрытые при комнатной температуре. Примечание: Собранный раствор можно хранить при 4 ° С и повторно три раза. Для хранения более 2 недель может привести к жидкости буреют (образование кристаллов), где на его необходимо выбросить. Культура фибробластов: Выращивают и поддерживать MRC-5, (человеческий клеточной линии фибробластов легких, полученную из нормальной легочной ткани 14-недельных самцов плода), в полной среде DMEM в 5% СО 2 при 37 ° С. Используйте фибробласты на 24-26 проходов и не расти, пока 70-80% сливной. Примечание: Маркет Репорт-5 клеточная линия при прохождении> 30 теряют морфологию и не рекомендуется для использования в модели ткани. Культура эпителиальных клеток: Получить 16HBE14o- (16HBE), иммортализованной бронхиальной эпителиальных клеток человека линии, которая сохраняет дифференцированный морфологию и функцию эпителия человека нормальной дыхательных путей, (это был подарок от д-р Дитер Gruenert, горе Сион онкологический центр, Университет Калифорнии, Сан-Франциско , США 10).. Культура клеток в 16HBE фибронектина / коллагеновых покрытием колбы и поддерживать клетки в полном МЕМ в 5% СО 2 при 37 ° С. Подготовка 5x DMEM Подготовка 5x DMEM путем растворения 13,4 г DMEM порошка и 3,7 г бикарбоната натрия в 150 мл стерильной дистиллированной воды. Отрегулируйте рН среды до 7,3, составляют объем до 200 мл и фильтруют его, используя 0,22 мкм мембранный фильтр. Сбор отфильтрованной среды в стерильный контейнер и хранили до использования при комнатной температуре. 2. Подготовка Коллаген-встроенных фибробластов Оттепель замороженных аликвот FBS и L-глутамина в С на водяной бане 37 °.После оттаивания сохранить образцы на льду. Поместите бикарбоната натрия (71,2 мг / мл) и гентамицин (50 мг / мл) при 4 ° С. Предварительного охлаждения 50 мл центрифужные пробирки и 10 мл стерильные пипеток до 4 ° С. Примечание: Все материалы, используемые (кроме 5-кратным DMEM) охлаждены на льду до использования, и все шаги выполняются на льду. Тип I бычьего коллагена (1,1 мг / мл) должны храниться холодной, так как это предотвращает затвердевание коллагена. Подготовка фибробластов: Теплый Трипсин в ° C водяной бане при 37 и инкубировать с достаточное количество легочных фибробластов (MRC-5) клеток в течение 10 мин при 5% СО 2 при 37 ° С. Нейтрализовать трипсина путем добавления DMEM, 1x завершена. Аспирируйте клеточной суспензии и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 2,3 х 10 5 клеток / мл в DMEM полных. Поместите клетки на льду до готовности к использованию. Подготовка премикса: Добавьте следующее в трубе с надписью "премикс"; 395мкл 5x DMEM, 40 мкл L-Глютамин, 120 мкл NaHCO3 (71,2 мг / мл), 440 мкл ФБС, 5 мкл гентамицин (50 мг / мл), общий объем 1000 мкл, а затем встряхните перед хорошо перемешать и поставить на льда. Примечание: Объемы приведены для вставки культуры один 24 мм 6-а. Рассчитать конкретные суммы, требуемые для общего количества вставок, но добавить один дополнительный, чтобы быть уверенным, достаточно премикс готов. Подготовка бесклеточной коллагена смесь: Для каждой культуры добавляют 1 мл бесклеточной коллагена смеси. Добавьте следующее в 50 мл коническую трубку на льду в указанном порядке; 686 мкл 1,1 мг / мл коллагена, 250 мкл премикс и 64 мкл 1х полное DMEM до общего объема 1000 мкл в. Смешайте раствор хорошо не обеспечивая пузырьков воздуха. Работа быстро и добавить коллагена на стенке трубки, чтобы избежать воздушных пузырей. Добавить 1 мл бесклеточной слой смеси вставки размещены в плите 6 скважины. Не добавляйте носитель к колодцу за пределами вставки. Вcubate в течение 30 мин в 37 ° С инкубатор. Убедитесь, что бесклеточная смесь покрывает всю вставку без каких-либо воздушных пузырьков. Подготовьте клеточный коллаген смесь: Смешайте компоненты клеточной слоя в 50 мл коническую пробирку держали на льду в следующем порядке; 2 мл Коллаген, 615 мкл предварительного смешивания, 58 мкл 1x полной DMEM и 327 мкл суспензии клеток легких фибробластов (MRC-5), чтобы составить общий объем до 3000 мкл. Каждая культура требует 3 мл клеточной коллагена смеси. Важным шагом: Убедитесь, что смешивать коллагена и премикс тщательно перед добавлением клеточной суспензии. Это нейтрализует рН коллагена, чтобы избежать токсического воздействия на фибробластов. Добавить сотовой слой (3 мл) в верхней части слоя бесклеточной коллагена и инкубируют в течение 2 ч в 37 ° C инкубаторе. Работа быстро и добавить коллагена на стенке трубки, чтобы избежать воздушных пузырей. После полимеризации, добавить 2 мл DMEM полные ТОн дно 6-луночный планшет (при вставке) и инкубируют в течение 24 ч. ПРИМЕЧАНИЕ: Если полимеризации не происходит, отбросить пластинчатые вкладыши, содержащие фибробластов коллагеновой матрицы и пуско-снова. Наиболее вероятной причиной ошибки в дополнение или неправильной объема одного из перечисленных выше реагентов. 3. Непрерывная культура фибробластов коллагена Matrix Осторожно поднимите вставку с помощью чистой щипцов и аспирации питательных сред из нижней части скважины. Добавить 2 мл DMEM полной до дна скважины с последующим 2 мл DMEM полной во вставке. Избегать введения пузырьков воздуха под вставкой, так как это позволит предотвратить диффузию питательных веществ между внешней и внутренней камерами. Удалить пузырьки воздуха с наконечником микропипетки. Изменение питательных сред (внутри и ниже вставки) каждый второй день, а культуру в течение примерно 5-7 дней. Будьте осторожны при удалении носителя из вставки. Чтобы избежать КонтаКТ с фибробластов коллагена матрицы, слегка наклоните вставку с помощью чистой щипцов и аспирации СМИ от вставки стен. ВАЖНЫЙ ШАГ: фибробласты в коллагеновой матрице должны получить удлиненную фенотип, и переделывать коллаген, который затем контракты. В 5-7 дней, матрица заключил контракт, чтобы сформировать платформу (10-14 мм в диаметре) в центре пластины. Контрактный матрица готова к использованию в следующей стадии. Чтобы получить равномерное сжатие матрицы очень важно, что фибробласты хорошо смешивают с коллагеном перед посевом (этап 2.6.1). 4. Посев иммунных клеток (Infected / Неинфицированные моноцитов-макрофагов смесь) Примечание: Следующие шаги включают экспериментальные вирулентных микобактерий, и поэтому должны быть выполнены в BSL-3 объекта. Приготовление первичных моноцитов и макрофагов: Изолировать моноцитов периферической крови от доноров крови с помощью establiпролить протокол. Изолировать моноциты в тот же день, как создание модели тканей и культуры и дифференцировать их в макрофаги в течение примерно 7 дней до заражения М. туберкулез. ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет гарантировать, как макрофаги и контракт фибробластов коллагена матрица доступны через 7 дней. Также изолировать свежие моноциты, которые будут добавлены вместе с зараженными макрофагов. Подготовка М. туберкулез -infected макрофаги Заготавливают культивированные бактерии, помыть с 1x PBS, содержащий 0,05% Твин-80, ресуспендируют в антибиотиков без полного DMEM, проходят через усеченного стерильной иглой 27 G для разгона бактериальных сгустки и измерения оптической плотности. Примечание: Предварительно определить М. туберкулез колониеобразующих единицы эквиваленты оптической плотности в лаборатории. Это даст оценку числа бактерий, которые будут использоваться для инфекции. Выдержите макрофаги в течение 4 часов с М. туберкулез в множественности заражения (МВД) 10). После заражения, промойте 3 раза с 1x PBS, чтобы удалить внеклеточных бактерий. Использование неинфицированных макрофагов культивировали таким же образом, но без М. туберкулез, в качестве контроля. Отделить макрофаги из культуральной пластины с помощью обработки 2 мМ ЭДТА в течение 10 мин при 37 ° С и ресуспендировали клетки в без антибиотика полной среде DMEM. Маркировка моноцитов Примечание: Выделение и маркировка моноцитов может быть выполнена в BSL-2 скамьи, а затем принимать во BSL-3 установки для дальнейшей обработки. Пятно свежеприготовленные моноциты (2 х 10 7 клеток) с конечной концентрации 2 мкМ PKH26 красного красителя в течение 5 мин, в соответствии с инструкциями изготовителя. Промыть 3 раза и клетки вновь суспендируют с без антибиотика полной среде DMEM при плотности 1 х 10 7 клеток / мл. Добавление иммунных клеток, чтобы фибробластов-коллагеновый матрикс осле 5-7 дней культуры фибробластов-коллагеновый матрикс, аспирата из среды культуры внешних и внутренних камер и добавить 1,5 мл свежей без антибиотика DMEM полной к наружной камере. Подготовьте меченого моноцитарно-макрофагальной (неинфицированных / зараженной) смеси с соотношением Mo: MQ (5: 1) в 50 мкл DMEM завершена. Для 50000 макрофагов, принять 250000 меченых моноцитов. Добавить 50 мкл МО: MQ смеси до фибробластов-коллагенового матрикса и инкубируют в течение 1 ч в 5% СО 2 при 37 ° С. После инкубации, осторожно добавляют 2 мл культуральной среды во вставку и инкубировать в течение дополнительных 24 ч в 5% СО 2 при 37 ° С. Примечание: В клетки добавлены свободно прикреплена, добавление сред должно быть медленным, осторожно добавив на стенках вставки. 5. Посев легких эпителиальных клеток (16HBE) Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены в BSL-3 объекта. Семя легких электроннойpithelial клетки (16HBE) в верхней части МО: MQ-фибробластов коллагена слоя. Для этого, во-первых отделить 16HBE клетки от колбы путем обработки трипсином (как в 2.2.1.) И ресуспендируют в 4 х 10 6 клеток / мл в антибиотиков без DMEM. Аспирируйте культуральной среды внутри и за пределами вставки. Затем добавить 1,5 мл без антибиотика DMEM полной в забое скважины за пределами вставки. Добавить 50 мкл 16HBE сверху иммунных клеток фибробластов матрицы коллагена. Оставьте на 2 мин в капюшоне и инкубировать в течение 1 часа в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. После инкубации добавляют мягко 2 мл без антибиотика DMEM полной пределах вкладыша и культуры при 37 ° С в течение 3 дней. Стадию культура способствует пролиферации эпителиальных клеток в модели ткани. Примечание: В клетки добавлены свободно прикреплена, добавление сред должно быть медленным и нежным, сдвинув через стенки вкладыша. 6. Воздух-экспозиция 3D легкихМодель Примечание: После 5-й день после того инфицированных макрофагов, модели ткани воздуха подвергаются и следующие шаги должны быть выполнены в BSL-3 объекта. Аспирируйте культуральной среды внутри и за пределами вставки. Примечание: На этом этапе супернатанты могут быть собраны для обнаружения секретируемых факторов. Центрифуга, стерильно фильтровать и хранить супернатанты при -70 ° С. Добавить 1,8 мл антибиотика свободной DMEM полные в наружной камере и инкубируют в 5% СО 2 при 37 ° C инкубаторе в течение 2 дней. Не добавлять культуральной среды в вставки. Примечание: с воздушным снятие модели ткани способствует образованию слоистой эпителия и секреции слизи, который обеспечивает прочность к ткани и физиологического сходства с человеческой легочной ткани. 7. Сбор и Монтаж 3D легочной ткани Модель Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены в BSL-3 объекта. На 7 день после имплантации инфицированных макрофагов, модели ткани готовы для сбора урожая. Удалить культуру средств массовой информации полностью от модели ткани. Исправление модели ткани 4% параформальдегидом в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. Этот шаг убивает бактерии и фиксирует ткани / морфологии клеток для дальнейшей обработки. Используя скальпель, отделить мембрану от вставки скважины. Передача мембрану, содержащую ткани на лунку, содержащую 1x PBS. Отрежьте стороны модели ткани с помощью чистой скальпель. Затем нарезать модель ткани в 4 примерно равные квадратные кусочки. Перевести кусок ткани на более SuperFrost стекло. Хранить куски ткани в 1x PBS при 4 ° С. Высушите ткани в течение 5 мин и смонтировать с помощью продлить Gold antifade с DAPI и покровное. Оставить слайды без нарушения не в темноте при комнатной температуре до полного высыхания. Примечание: Толщина ткани могут различаться между центром и периферией, вызывая небольшое Tiltiнг покровное. Чтобы избежать этого, распорка (например парафином) могут быть размещены на углу покровным стеклом. Применить лак для ногтей по краям покровного стекла и дайте ему высохнуть. Погружают слайдов в 70% этанола, чтобы сделать их безопасными, чтобы принести из BSL-3 объекте. 8. Визуализация, приобретение и количественный анализ 3D Визуализируйте ткани слайды, используя микроскоп конфокальной системы с лазеры на 488 нм для возбуждения GFP (зеленый канал), 420 нм для DAPI (синий) и 555 нм для PKH26 меченных моноцитов (красный), соответственно. Приобретение 3D изображения с разрешением 512х512 с Z-стеки покрытия, как минимум, 20 мкм толщиной и имеющие 1 – 1,5 мкм расстояние между стеками. Приобретать 5-10 различные поля, охватывающие весь кусок ткани. Примечание: Используйте конфигурацию, например, Никвист оптимальных настроек оптическим разрешением (длина волны, мощности лазера / воздействия, размер пикселя и масштабирования). Избегайте ООНдер или перенасыщение пикселей. Анализ конфокальной изображения с помощью программного обеспечения 3D обработки изображений. Для 3D количественного клеточных кластеров, то рекомендуются следующие шаги для оптимального анализа. Откройте программное обеспечение для обработки изображений 3D и загрузить изображение. Измерьте размеры объектов, которые будут проанализированы в изображении, например, размер ядра, индивидуальный моноцитов и одиночных бактерий. Эти наблюдения могут быть использованы для определения или фильтрации объектов. Используя инструмент настройки дисплея, оптимизировать объем рендеринга путем корректировки каждого канала для контраста изображения, яркость и смешать непрозрачность. Этот шаг является сведение к минимуму помехи шума в объеме рендеринга. Примечание: гамма-коррекция может привести к манипулированию изображений и, следовательно, его следует избегать. Создать поверхностей от выбора красного канала (моноциты) и установить порог (автоматический или ручной выбор). При необходимости, используйте фильтры, чтобы ограничить выбор красных моноцитов или исключить бackground. Точно так же, создания поверхностей для зеленого (М. туберкулеза) и голубой (ядер) каналов, как описано выше. Экспорт данных в файлы MS-Excel. Можно экспортировать конкретный параметр или все данные. Параметры, которые имеют отношение к анализу клеток кластеризации объем, интенсивность, количество объектов, количество вокселей и сферичности. Сохранение и экспорт изображений в подходящем формате изображения предпочтительно TIFF. ПРИМЕЧАНИЕ: Анимации также можно сделать с помощью меню анимации и сохранить как медиа-файла. Сохранить настройки анализа каждого канала, используя опцию добавления параметров и могут быть получены позднее с помощью функции Восстановление. Одновременно анализировать несколько файлов, используя инструмент пакетной обработки. Примечание: Все изображения для параллельного должны быть приобретены, обработаны и проанализированы таким же образом. Например A 8-битное изображение (256 целое число) не должно быть по сравнению с 12-битное изображение (4096) целого.

Representative Results

3D-модель легочной ткани человеческого туберкулеза могут быть эффективно использованы для изучения хозяин-патоген взаимодействия в М. туберкулезная инфекция. Основные этапы этого способа, представительные микроскопические изображения различных этапов и общей микроскопической структуры раздела тканей описаны на рисунке 1. Модель имеет несколько компонентов человеческой легочной ткани, в том числе легочных фибробластов, бронхиальных эпителиальных клеток и первичных моноцитов / макрофагов встроен в среде 3D ткани. Кроме того, включение компонентов человеческого легочной ткани, модель напоминает физиологических условиях, а именно расслоение эпителия и секрецию слизи. Примером использования модели легких тканей в области мониторинга инфекции ТБ представлена на рисунке 2. Для визуализации М. туберкулез -immune миграцию клеток и взаимодействия, мы ввели макрофаги, инфицированные M. туберкулез, которые выражают GFP(зеленый) вместе с свежеизолированных PKH26 меченных моноцитов (красный) в модели ткани (синий, DAPI окрашенных ядер). На 7 день после того М. туберкулез -infected клетки к модели ткани, конфокальной микроскопии показывает кластеризации красных моноцитов на сайте инфекции (зеленый) (рис 2), которая имитирует отличительной чертой поражения человека ТБ 9. Серия представительных изображений для 3D визуализации М. туберкулез -infected модель ткани и количественная оценка клеточных кластеров показано на рисунке 3. 3D-визуализация дает пользователю гибкость, чтобы взаимодействовать, исследовать и количественно несколько особенностей в 3D изображении. Пространственное расположение зеленых бактерий и красных кластеров моноцитов видно из апикальной, вращательного и боковым видом, как показано на фигуре 3В, который показывает кластеризации моноцитов на участке М. туберкулез. Кластеры не-об-служил в неинфицированных тканей (рис 3а). Мы количественно размер и количество моноцитов кластеров клеток и обнаружили, что размер (объем) кластеров клеток усиливается (р <0,001), в то время как число индивидуальных моноцитов уменьшилось (р <0,01) в М. туберкулез инфицированных тканей по сравнению с моделями неинфицированных тканей (фиг.3С и 3D). Эти данные подтверждает нашу предыдущую нахождение начале формирования гранулемы в М. туберкулезная инфекция наблюдается в моделях легочной ткани, анализируемых в 2D срезов 9. Наши данные показывают, что модель ткани обеспечивает естественную среду обитания 3D исследовать комплекс хозяина клеточную М. Сеть туберкулез связи. Мы также обнаружили, что 3D визуализация и количественный анализ являются лучшими инструментами для изучения особенностей в модели ткани (рисунок 3). Количественное определение кластера чеек (гранулемы, например) часто стретч HES до нескольких слоев клеток и может быть полностью захвачен 3D количественного анализа. Кроме того, визуализация точных пространственных и временных характеристик отдельных клеток или бактерий в модели позволяют жить-изображений, миграция и отслеживания исследования в назначенной лаборатории. Рисунок 2. моноцитов в модели ткани кластера вокруг опасной М. туберкулез. Представительства конфокальные изображения неинфицированных и М. туберкулез модель инфицированных тканей представлена. Панели из зеленого (М. с туберкулезом GFP), красные (PKH26 меченных моноцитов), синий (DAPI-окрашенные ядра) и объединенные каналы показывают набор моноцитов в инфицированной ткани по сравнению с неинфицированных тканей. Масштаб – 100 мкм.large.jpg "стиль =" Размер шрифта: 14px; высота строки: 28px; "цель =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. 3D визуализации и количественного анализа модели ткани содержат полезную информацию. Типичные изображения 3D визуализации всей модели ткани (А) незараженные ткани, (Б) инфицированных M. туберкулез, через оптический срезов с использованием Zeiss LSM700 конфокальной микроскопии и количественного анализа Imaris программного обеспечения для обработки изображений (версия 7.6.8). Эти изображения были получены при увеличении 20Х, 14 Z-стеки, охватывающих толщину тканей 19,5 мкм с 1,5 мкм интервала, позволяя визуализацию с апикальной, вращательного горизонтальной, вертикальной и вращательного сбоку (А и В). (С) условиемntitative анализ кластеров моноцитов клеток выявляют расширение (р <0,0001) размер кластеров начале гранулемы после М. туберкулезная инфекция по сравнению с отсутствием инфекции. (D) Количественное определение числа моноцитов показали снижение (р <0,01) в пораженной ткани по сравнению с неинфицированных тканей, вновь более кластеров в инфицированной ткани. Зеленый – М. туберкулез -GFP, красный – PKH26 меченные моноциты, синий – клеточные ядра, шкала -. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB ¹¹. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination ¹². A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination.

A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB ^13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB ¹⁷, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines ^8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion ⁹.

The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions.

Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis ⁹. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation ¹². As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method ⁹. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria ¹⁸ and induction of necrosis ¹¹.

Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen ⁸. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.

In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Linköping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.

Materials

Cell culture inserts	BD Falcon	353092
6-well culture plates	BD Falcon	353046
MRC-5 cells, lung fibroblasts			ATCC#CCL-171
16HBE cells, lung epithelial cells			Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA
5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM)	Gibco	12800-082	Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 µm filter.
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with glucose (DMEM) 1x	Gibco	41965-039
Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle’s salts	Sigma	M4655
Non-Essential Amino Acids Solution, 100x	Life Technologies	11140-035
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-024
Sodium Pyruvate	Life Technologies	11360-039
NaHCO3 (71.2 mg/ml)			Prepared in house
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Heat inactivated for 30 min, 56 °C
Gentamicin (50 mg/ml)	Gibco	15750-060
Hepes buffer solution 1M	Gibco	15630-056
Penicillin Streptomycin (Pen Strep)	Gibco	15140-122
Lymphoprep	Axis-Shield	7801
Ultrapure 0.5 M EDTA	Gibco	15575
Bovine Collagen PA treated (500 ml)	Organogenesis	200-055
Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml)	Advanced biomatrix	5005-B
Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg)	BD	354008
Primary human monocytes/macrophages			Isolated from human whole blood or buffy coats.
PKH26 Red fluorescent cell linker	Sigma	MINI26
Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein			M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.
Middlebrook 7H9 medium	Difco	271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment	BBL	211887
Tween-80
Glycerol
Kanamycin B sulfate (20 µg/ml)	Sigma	B5264
Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935
Trypsin -EDTA
Bovine serum albumin
Paraformaldehyde
DAPI
LSM700 Confocal microscope	Zeiss
iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8	Bitplane AG

References

Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary pathology. 49, 423-439 (2012).
Saunders, B. M., Britton, W. J. Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis. Immunol Cell Biol. 85, 103-111 (2007).
Kaufmann, S. H. New issues in tuberculosis. Ann Rheum Dis. Ann Rheum Dis. 63, ii50-ii56 (2004).
Morrison, J., Pai, M., Hopewell, P. C. Tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of people with pulmonary tuberculosis in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 8, 359-368 (2008).
Barry 3rd, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 845-855 (2009).
Puissegur, M. P., et al. An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells. Cell Microbiol. 6, 423-433 (2004).
Kapoor, N., et al. Human Granuloma In Vitro Model, for TB Dormancy and Resuscitation. PLoS One. 8, e53657 (2013).
Nguyen Hoang, ., T, A., et al. Dendritic cell functional properties in a three-dimensional tissue model of human lung mucosa. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L226-L237 (2012).
Parasa, V. R., et al. Modeling Mycobacterium tuberculosis early granuloma formation in experimental human lung tissue. Dis Model Mech. 7, 281-288 (2014).
Cozens, A. L., et al. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
Brighenti, S., Andersson, J. Local immune responses in human tuberculosis: learning from the site of infection. J Infect Dis. 205, S316-S324 (2012).
Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136, 37-49 (2009).
Gupta, U. D., Katoch, V. M. Animal models of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 85, 277-293 (2005).
Kashino, S. S., Napolitano, D. R., Skobe, Z., Campos-Neto, A. Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection. Microbes Infect. 10, 1469-1476 (2008).
Singhal, A., et al. Experimental tuberculosis in the Wistar rat: a model for protective immunity and control of infection. PLoS One. 6, e18632 (2011).
Subbian, S., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition alters gene expression and improves isoniazid-mediated clearance of Mycobacterium tuberculosis in rabbit lungs. PLoS Pathog. 7, e1002262 (2011).
Lin, P. L., et al. Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model. Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).
Rahman, S., et al. Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions. Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection. J. Vis. Exp. (104), e53084, doi:10.3791/53084 (2015).

Automatically Generated