学習の離散段階中げっ歯類におけるリモートサイレン神経活動のための方法

行動神経科学の分野内の刺激的な課題は、複雑な行動の神経基盤を決定することです。このような永久的な病変、カニューレインプラントを介して、一時的な脳の不活性化および光遺伝学などの多くの技術は、複雑な動作のサブコンポーネントに個別の脳領域の寄与を識別するために使用されてきました。これらのアプローチは、学習中に地域特異性の我々の理解を通知するが、各手法には限界がないわけではありません。具体的には、永久的な病変は、典型的には、ので、それらの影響は、パラダイムの期間全体に存在している、行動試験の前に実施されます。短期神経不活性化（ 例えば、テトロドトキシン）の提示を伴う挿管の研究は、脳組織に重大な障害を生成することができますし、直前の行動試験に被験者にストレスを誘導することができます。また、挿管を介して不活性化は、周囲の組織の領域に限定されていますカニューレの先端。光遺伝学は、特定の脳領域における活動の時間的制御のための柔軟性の範囲を提供しています最後に、それはコスト法外と技術的に厳しいです。

これらの制限は、薬理遺伝学的ア ​​プローチ（デザイナ-受容体-排他的活性化·バイ·デザイナードラッグ^{、DREADDs）1,2を}使用して克服することができます。薬理遺伝学の概念は洗練されながら重要なこと、技術の実行は簡単です。個別の脳領域への毒素の注入（ 例えば、NMDA、イボテン酸）を含む従来の定位外科的方法と同様に、この手法は、修正阻害Gタンパク質共役受容体のためのDNA断片を含有するアデノ随伴ウイルス（AAV）を注入することを含みます（hM4Di;デザイナー受容体）の標準的な実験用げっ歯類の関心領域には（ 図1参照します）。ウイルスベクターはまた、蛍光レポーター（mcitrine）が含まれています。に組み込まれたら細胞に、デザイナーの受容体（およびレポータータンパク質）は、最大で2〜3週間後に注入を発現し、選択的に他の方法で生物学的に不活性なデザイナーの薬剤の全身投与、クロザピン-N-オキシドにより2-5時間のために活性化することができます^{（CNO）1 、3。}実験者は、特定の脳領域における神経活動を正確に、しかも遠隔時間的制御に恵まれているので、薬理遺伝学は、複数のフェーズで実施されている行動パラダイムで特によく兼ね備えています。この例では、retrosplenial皮質（RSC）の寄与がする刺激 – 刺激学習がパブロフ学習におけるその役割と比較され、アプローチのしかし、この組み合わせはに貢献どのように特定の脳の領域を識別しようとするのいずれかの質問の数に適しています複雑な挙動。

本プロトコールに記載されていないがまた、ウイルスおよびトランスジェニックアプローチは、細胞型特異的DREADD式^2を達成することができます。私のようにDREADDアプローチを採用した場合、薬理学的および/または実験操作の他のタイプを伴う行動パラダイムに内在するのは、実験計画とその後の定量分析を慎重に検討が必要です。 DREADDアプローチの新しい実験者は、現在のDREADD技術²の包括的見直しと呼ばれています。

毎日、生物は新たな刺激やイベントと相互にそれらの関係について学びます。でも使い慣れた環境では、そのような家庭のように、1は、これらの変更は、意味のあるイベントを予測することができるので、刺激間の関係の変化を検出するために迅速です。このような刺激-刺激（ すなわち、関係）学習は、複数の刺激の対等接続を必要とし、伝統的な内側頭葉⁴内の中央に置かれ、海馬、と関連しています。しかし、海馬が存在したり、単独では動作しません。内と外の両方の皮質領域内側側頭葉の側は海馬^5-7に重要な感覚情報を提供しています。伝統的な永久的な損傷の研究は、海馬依存性学習における皮質領域（ 例えば、retrosplenial、postrhinalおよび嗅内皮質）の数の関与のための説得力のある証拠を提供するが、離散段階で特定の領域の役割を認識する能力が制限されています^8-10を学びます。

本プロトコルは、RSCは、3相の感覚プレコンディショニングのパラダイム^11,12の単相中にRSCをサイレンシングすることによって刺激刺激学習のために必要であるという仮説をテストします。簡単に言うと、ラットは、デザイナーの受容体を含有し、2〜3週間後に行動試験の開始前にデザイナーの薬（CNO）30分を投与されたAAVの注入を受けます。本プロトコルでは、実験的なラットは、テストの第一段階（刺激 – 刺激リア中CNOを受け取りますNingが発生する）、彼らはテストの次の2段階の間に車両を受けます。行動上のCNOの不注意の影響を制御するには、デザイナーの受容体（hM4Di）のラットを注入し、代わりにCNOの車両に注入します。ウイルス注入および受容体の発現の全体的な影響を考慮するために、デザイナーの受容体を含有し、CNOを投与しない対照ウイルスを注入。

AAVの種々の血清型の数は、遺伝物質を送達するために使用されます。組換えまたは合成分子が関与する研究のための現在のNIHガイドラインは、導入遺伝子が潜在的に腫瘍形成遺伝子産物または毒素分子のいずれかをコードしないとの非存在下で産生される、AAV（すべての血清型）および組換えまたは合成AAV構築物と主張しますヘルパーウイルスは、BSL-1注意事項（付録B-1。リスクグループ1（RG1）エージェント^）13が必要です。 AAV構造、ユーティリティおよび安全性に関連するレビューの数は^14,15利用できます。注目すべきは、しかしAAVで作業する場合、げっ歯類では可能な生殖^16,17および潜在的な発がん性のメカニズム^18-20に関連する問題のために、いくつかの機関は、BSL-2の予防策を使用する必要があります。米国では遺伝子操作のためのウイルスベクターを使用する場合に研究のための疾病管理センターおよびNIHガイドラインは組換えDNA分子^13を伴う、研究を実施する個々の機関の監督委員会との協議により、使用前に適切なBSLを確認してください。個人用保護具、研究者の訓練、ベクトル封じ込め、除染、除染材料の廃棄、および注射後の動物収容要件は、これらのガイドラインで指定されています。また、相談して、適切な動物実験に続き、安全な取り扱い、管理、およびAAVの処分を確保するために、委員会のガイドラインまたは同等の機関監督委員会のガイドラインを使用してください。