Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem

Um emocionante desafio dentro do campo de neurociência comportamental é determinar os substratos neurais de comportamentos complexos. Um certo número de técnicas, tais como lesões permanentes, a inactivação do cérebro através de implantes temporários cânulas e Optogenetics foram utilizados para identificar as contribuições de regiões cerebrais discretas de subcomponentes de comportamentos complexos. Embora estas abordagens informar a nossa compreensão da especificidade regional durante a aprendizagem, cada técnica não é sem limitações. Especificamente, lesões permanentes são tipicamente conduzida antes do teste comportamental, assim os seus efeitos estão presentes ao longo da duração do paradigma. Canulação estudos que envolvem a apresentação de um inactivador neural de curto prazo (por exemplo, tetrodotoxina) pode produzir danos substanciais para o tecido cerebral e podem induzir o stress em indivíduos apenas antes do teste comportamental. Além disso, a inactivação por meio de punção é limitada à região de tecido que envolve oponta da cânula. Por último, enquanto optogenética oferece uma gama de flexibilidade para o controle temporal da actividade em regiões específicas do cérebro, que é o custo proibitivo e tecnicamente exigente.

Essas limitações podem ser superadas através de uma abordagem farmacogenética (designer-receptores activados Exclusivamente-a-Designer-Drogas, DREADDs) ^1,2. Mais importante, embora o conceito de farmacogenética é sofisticada, a execução da técnica é simples. Similar aos métodos cirúrgicos estereotáxicas tradicionais que envolvem a infusão de uma toxina (por exemplo, o NMDA, ácido iboténico) em regiões cerebrais discretas, esta técnica envolve a infusão de um vírus adeno-associado (AAV) que contém um fragmento de ADN para um inibidor do receptor modificado acoplado a proteína G (hM4Di; o receptor designer) para a região de interesse de roedores laboratoriais padrão (ver Figura 1). O vector viral também contém um repórter fluorescente (mcitrine). Uma vez incorporados nopara as células, o desenhador do receptor (e proteína repórter) são maximamente expressa três semanas pós-infusão ~ e pode ser activada selectivamente para 2-5 horas por administração sistémica da droga desenhador de outra forma biologicamente inerte, clozapina-N-óxido (CNO) ^{1 , 3.} Porque o experimentador é dotado de controle temporal preciso, ainda remota sobre a atividade neural em regiões específicas do cérebro, farmacogenética combina muito bem com paradigmas comportamentais que são realizados em várias fases. Neste exemplo, a contribuição do córtex retrosplenial (RSC) ao estímulo-estímulo de aprendizagem é comparado com o seu papel na aprendizagem pavloviano, porém essa combinação de abordagens é bem adequado para qualquer número de questões que buscam identificar regiões do cérebro como específica contribuir para comportamento complexo.

Além disso, embora não descritos no presente protocolo, virais e abordagens transgénicas podem ser usadas para atingir células de tipo específico DREADD expressão ^2. Como is inerente em paradigmas comportamentais que envolvem tipos farmacológicos e / ou outras das manipulações experimentais, uma análise cuidadosa do desenho experimental e análise quantitativa subsequente é necessário quando se utiliza a abordagem DREADD. Experimentadores novas para a abordagem DREADD são encaminhados para uma avaliação abrangente da tecnologia atual DREADD ^2.

Cada dia, os organismos aprender sobre novos estímulos e eventos e seus relacionamentos entre si. Mesmo em um ambiente familiar, tais como casa, é rápido para detectar alterações nas relações entre estímulos, porque essas alterações podem ser preditivos de eventos significativos. Tal estímulo-estímulo (isto é, relacional) aprendizagem envolve a conjunção de vários estímulos e, tradicionalmente, tem sido associada com o hipocampo, que reside centralmente dentro do lobo temporal medial ^4. No entanto, o hipocampo não existe nem actuar isoladamente; regiões corticais, tanto dentro como foralateral do lóbulo temporal medial fornecer informação sensorial crítica para a formação do hipocampo ^5-7. Os estudos tradicionais permanentes lesão fornecem evidências convincentes para o envolvimento de um número de regiões corticais (por exemplo, os córtices retrospl�icos, postrhinal e entorrinal) na aprendizagem dependente do hipocampo, mas são limitados em sua capacidade de discernir o papel de uma determinada região durante as fases discretas de ^8-10 aprendizagem.

O presente protocolo testa a hipótese de que a RSC é necessária para a aprendizagem estímulo-estímulo ao silenciar a RSC durante uma única fase de um 3-fase de pré-condicionamento sensorial paradigma ^11,12. Resumidamente, os ratos recebem uma infusão de AAV que contém o receptor de design e ~ 3 semanas mais tarde são administrados a droga Designer (CNO) 30 minutos antes do início do teste de comportamento. No presente protocolo, os ratos experimentais receber CNO durante a primeira fase de testes (quando lear estímulo-estímuloning ocorre) e eles recebem veículo durante os próximos 2 fases de testes. Para controlar os efeitos involuntários de CNO no comportamento, infundir ratos com o receptor designer (hM4Di) e injetar com veículo em vez de CNO. Para dar conta de efeitos gerais de infusão viral e expressão do receptor, infundir um vírus de controle que não contém o receptor designer e administrar CNO.

Um número de diferentes serotipos de AAV são utilizadas para entregar material genético. Os actuais orientações NIH para a pesquisa envolvendo recombinante ou moléculas sintéticas que mantém AAV (todos os serotipos) e construções de AAV recombinantes ou sintéticos, em que o transgene não codifica um produto de gene ou potencialmente carcinogénicos ou uma molécula de toxina e são produzidos na ausência de um vírus auxiliar, exigem precauções BSL-1 (Apêndice B-1. Risco do Grupo 1 (RG1) agentes) ^13. Uma série de avaliações referentes à estrutura de AAV, utilidade e segurança estão disponíveis ^14,15. Notavelmente, embora, Devido a preocupações relativas a possíveis reprodutivos ^16,17 e mecanismos potenciais cancerígenos ^18-20 em roedores, algumas instituições exigem o uso de BSL-2 precauções quando se trabalha com AAV. Verifique a BSL apropriado antes de usar, consultando os comitês de supervisão em instituições individuais em que a investigação será conduzida, os Centros de Controle de Doenças e as Diretrizes do NIH para a pesquisa envolvendo moléculas de DNA recombinante ¹³ ao usar vetores virais para manipulação genética nos Estados Unidos. Protecção individual, de formação investigador, contenção vetor, descontaminação, eliminação de materiais descontaminados, e pós-injeção de animais requisitos habitacionais são especificados por estas orientações. Além disso, consultar e siga apropriado Institutional Animal Care e Use as orientações do comitê ou orientações do comitê de supervisão institucionais equivalentes para garantir o manuseio seguro, administração e alienação de AAV.