Un metodo per Remotely Silencing Neural Activity in Roditore Durante Fasi discreti di apprendimento

Una sfida emozionante nel campo delle neuroscienze del comportamento è quello di determinare i substrati neurali di comportamenti complessi. Un certo numero di tecniche come lesioni permanenti, inattivazione cervello temporaneo tramite impianti cannule e optogenetics sono stati impiegati per identificare i contributi di regioni cerebrali discreti per sottocomponenti di comportamenti complessi. Mentre questi approcci informano la nostra comprensione della specificità regionale durante l'apprendimento, ogni tecnica non è senza limiti. In particolare, le lesioni permanenti sono tipicamente condotte prima della prova comportamentale, quindi sono presenti in tutta la durata del paradigma loro effetti. Studi Incannulazione che comportano la presentazione di un inattivatore neurali a breve termine (ad esempio, la tetrodotossina) in grado di produrre danni rilevanti al tessuto cerebrale e possono indurre lo stress in soggetti appena prima del test comportamentali. Inoltre, inattivazione tramite cannulazione è limitata alla regione di tessuto che circonda lapunta delle cannule. Infine, mentre optogenetics offre una gamma di flessibilità per il controllo temporale dell'attività in regioni specifiche del cervello, è costo proibitivo e tecnicamente esigenti.

Queste limitazioni possono essere superate con un approccio farmacogenetica (Designer-recettori-Esclusivamente-Activated-by-Designer-Farmaci, DREADDs) ^1,2. È importante sottolineare che, mentre il concetto di farmacogenetica è sofisticata, l'esecuzione della tecnica è semplice. Simili metodi chirurgici stereotassica tradizionali che prevedono l'infusione di tossina (ad esempio, NMDA, ibotenico) in regioni cerebrali discrete, questa tecnica comporta infondendo un virus adeno-associato (AAV) che contiene un frammento di DNA per un recettore G-proteina inibitoria modificato accoppiato (hM4Di; il recettore designer) nella regione di interesse di roditori di laboratorio standard (vedi Figura 1). Il vettore virale contiene anche un reporter fluorescente (mcitrine). Una volta costituita inalle cellule, il recettore designer (e proteina reporter) sono massimamente espressi ~ 3 settimane post-infusione e possono essere selettivamente attivati ​​per 2-5 ore dalla somministrazione sistemica del farmaco progettista altrimenti biologicamente inerte, clozapina-N-ossido (CNO) ^{1 , 3.} Poiché lo sperimentatore è dotato di preciso, ma a distanza di controllo temporale su attività neurale in specifiche regioni del cervello, farmacogenetica abbina particolarmente bene con paradigmi comportamentali che si svolgono in più fasi. In questo esempio, il contributo della corteccia retrosplenial (RSC) a stimolo-stimolo di apprendimento viene confrontato con il suo ruolo nell'apprendimento pavloviano, ma questa combinazione di approcci ben si adatta a qualsiasi numero di domande che cercano di identificare come specifiche regioni del cervello contribuiscono a comportamento complesso.

Inoltre, pur non descritto nel presente protocollo, approcci virali e transgeniche possono essere utilizzati per ottenere specifici tipi cellulari espressione DREADD ^2. Come hos inerente a paradigmi comportamentali che coinvolgono farmacologici e / o di altri tipi di manipolazioni sperimentali, un attento esame del disegno sperimentale e la successiva analisi quantitativa è necessaria quando si impiega il metodo DREADD. Sperimentatori nuovi all'approccio DREADD si riferiscono a una rassegna completa delle attuali tecnologie DREADD ^2.

Ogni giorno, gli organismi conoscere nuovi stimoli e gli eventi e le loro relazioni gli uni agli altri. Anche in un ambiente familiare, come la casa, uno è rapido per rilevare alterazioni nei rapporti tra stimoli perché questi cambiamenti possono essere predittivi di eventi significativi. Tale stimolo-stimolo (ad esempio, relazionale) apprendimento implica la congiunzione di stimoli multipli ed è stato tradizionalmente associato con l'ippocampo, che risiede in posizione centrale all'interno del lobo temporale mediale ^4. Tuttavia, l'ippocampo non esiste nè agire isolatamente; regioni corticali sia all'interno e fuorilato del lobo temporale mediale fornire informazioni critiche sensoriali alla formazione dell'ippocampo ^5-7. Tradizionali studi lesioni permanenti forniscono prove del coinvolgimento di un certo numero di regioni corticali (ad esempio, le cortecce retrosplenial, postrhinal e entorinale) nell'apprendimento ippocampo-dipendente, ma sono limitate nella loro capacità di discernere il ruolo di una regione particolare durante le fasi discrete di apprendimento ^8-10.

Il presente protocollo verifica l'ipotesi che la RSC è necessaria per l'apprendimento stimolo-stimolo silenziando RSC durante una singola fase di un 3-fase di precondizionamento sensoriale paradigma ^11,12. Brevemente, ratti ricevono infusioni di un AAV che contiene il recettore progettista e ~ 3 settimane dopo sono somministrato il farmaco designer (CNO) 30 min prima dell'inizio della prova comportamentale. Nel presente protocollo, i topi sperimentali ricevono CNO durante la prima fase di test (quando stimolo-stimolo learning si verifica) e ricevono veicolo durante i prossimi 2 fasi di test. Per controllare gli effetti involontari di CNO sul comportamento, infondere ratti con il recettore designer (hM4Di) e iniettare con veicolo al posto del CNO. Per tenere conto di effetti generali di infusione virale e l'espressione del recettore, infondere un virus di controllo che non contiene il recettore designer e amministrare CNO.

Un certo numero di differenti sierotipi di AAV sono usati per fornire materiale genetico. Le attuali linee guida NIH per la ricerca coinvolgimento ricombinante o molecole sintetiche sostiene che AAV (tutti i sierotipi) e costrutti AAV ricombinanti o sintetici, in cui il transgene non codifica sia un prodotto del gene potenzialmente cancerogeno o una molecola di tossina e sono prodotti in assenza di un virus helper, richiedono BSL-1 precauzioni (Gruppo Appendice B-1. rischio 1 (RG1) agenti) ^13. Un numero di recensioni relative alla struttura AAV, l'utilità e la sicurezza sono disponibili ^14,15. In particolare, anche se, A causa delle preoccupazioni relative a possibili riproduttivi ^16,17 e meccanismi potenziali cancerogeni ^18-20 nei roditori, alcuni istituti richiedono l'uso di BSL-2 precauzioni quando si lavora con AAV. Verificare il BSL appropriata prima dell'uso attraverso la consultazione con i comitati di sorveglianza a singole istituzioni dove la ricerca sarà condotta, i Centers for Disease Control e le Linee Guida NIH per la ricerca che coinvolge DNA ricombinante Molecole ¹³ quando si utilizza vettori virali per la manipolazione genetica negli Stati Uniti. Protezione personale, formazione investigatore, vettore di contenimento, di decontaminazione, di smaltimento dei materiali decontaminati, e animali post-iniezione esigenze abitative sono specificati da queste linee guida. Inoltre, consultare e seguire appropriate Animal Care istituzionali e utilizzare le linee guida del comitato o orientamento equivalente di Vigilanza istituzionali per garantire la manipolazione, somministrazione e lo smaltimento di AAV.