Gleichzeitig<em> Ex vivo</em> Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em> In vivo</em> Elektroretinogramm-System
Summary
Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.
Abstract
An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.
Introduction
Elektroretinogramm (ERG) ist eine gut etablierte Technik, die verwendet werden können, um die elektrische Aktivität der Netzhaut durch Licht ausgelöst aufzuzeichnen. Die ERG-Signal wird hauptsächlich durch Spannungsänderungen durch radiale Ströme verursacht (entlang der Achse der Photorezeptoren und bipolare Zellen) in der Widerstands Extrazellularraum der Retina fließenden Strom erzeugt wird. Das erste Signal ERG wurde 1865 von Holmgren von der Oberfläche eines Fischauge 1 aufgezeichnet. Einthoven und Jolly 1908 2 unterteilt den ERG Reaktion auf das Auftreten von Licht in drei verschiedenen Wellen, a- genannt, B- und C-Wellen, die jetzt bekannt sind, um im Wesentlichen die Aktivität von Photorezeptoren widerspiegeln, ON bipolaren Zellen und Pigmentepithel Zellen, die jeweils 3-8. ERG aus den Augen der narkotisierten Tieren oder Menschen (in vivo) mit Mikroelektroden aufgezeichnet werden, aus isolierten Augen Vorbereitung 9, in isolierten intakten Netzhaut (ex vivo) 3,10-15 oder über bestimmte Netzhautschichten (lokaleERG) 4,16. Von diesen ist die in vivo ERG derzeit die am häufigsten verwendete Methode, um die Funktion der Retina zu bewerten. Es ist eine nicht-invasive Technik, die für diagnostische Zwecke verwendet werden kann oder um das Fortschreiten von Netzhauterkrankungen bei Tieren oder Patienten zu folgen. , In-vivo-ERG-Aufnahmen erzeugen jedoch eine komplizierte Signal mit mehreren überlappenden Komponenten, die oft von äußeren Augen physiologische Geräusche (zB Atmung und Herztätigkeit) kontaminiert.
Lokale ERG kann verwendet werden, um das Signal über bestimmte Schichten der Netzhaut aufzuzeichnen, aber es ist die invasive und hat die niedrigste Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zu den anderen ERG Aufzeichnungskonfigurationen. Lokale ERG ist auch technisch anspruchsvoll und erfordert teure Ausrüstung (zB Mikroskop und Mikromanipulatoren). Transretinal ERG von der intakten, isolierten Netzhaut (ex vivo ERG) bietet einen Kompromiss zwischen in vivo und lokale ERG Methoden, die stabil und high SNR Aufnahmen von intakter Netzhaut von Tieren oder Menschen 17. Vor kurzem wurde diese Methode erfolgreich eingesetzt, um Stäbchen und Zapfen Photorezeptorfunktion in Säugetieren, Primaten und menschliche Netzhaut 18-20 studieren. Darüber hinaus aufgrund der Abwesenheit von Pigment-Epithel in der ex vivo Retina, die positive C-Wellenkomponente des ERG-Signal entfernt wird und ein bekannter negativer langsamen PIII-Komponente ist in den ex vivo-Aufnahmen zeigte. Die langsame Komponente PIII wurde gezeigt, dass aus den von Müller Gliazellen in der Retina 21-23 stammen. Somit könnte ex vivo ERG Verfahren auch verwendet werden, um Müller-Zellen im intakten Netzhaut zu untersuchen. Mehrere Studien haben auch gezeigt, dass ex vivo ERG-Aufnahmen verwendet werden könnten, um die Konzentration von pharmakologischen Mitteln auf der Netzhaut 24 zu messen und testen Sie die Sicherheit und Wirksamkeit von Arzneimitteln 25-27 werden.
Mehrere Handels in vivo-Systemen zur Verfügung stehen undin vielen Laboratorien, die nicht unbedingt über umfangreiche Elektrophysiologie Hintergrund verwendet. Im Gegensatz dazu wurden ex vivo-Geräte nicht bis vor kurzem 17 und als Folge nur wenige Labors werden derzeit nutzen diese leistungsfähige Technik zur Verfügung. Es wäre von Vorteil, um unser Wissen über Netzhaut Physiologie und Pathologie voranzubringen und neue Therapien für Krankheiten zu entwickeln blend ex vivo ERG-Aufnahmen zur Verfügung, um weitere Labors zu machen. Wir zeigen hier eine einfache und erschwingliche ex vivo ERG Vorrichtung 17 und zeigen, wie sie in Verbindung mit mehreren im Handel erhältlichen in vivo ERG-Systeme verwendet werden, um Stab- und Kegel-vermittelten Signal aufzuzeichnen (a- und b-Wellen) und die Funktion Müller-Zellen (langsam PIII) aus intakten Wildtyp-Maus Netzhaut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir zeigen hier die entscheidenden Schritte zur gleichzeitigen Gewinnung hochwertiger ex vivo ERG Aufnahmen aus zwei isolierten Maus Netzhaut durch die Verwendung in vivo ERG Systemkomponenten zusammen mit einem Ex-vivo-ERG-Adapter. In dieser Studie haben wir die beiden perfundiert Retinae von dem Tier mit der gleichen Lösung (entweder Ames, Locke oder Ringer), aber es ist auch möglich, jeden Netzhaut mit einer anderen Lösung, zB perfundieren, Drogentestzwecke. Die wichtigste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse EY019312 und EY021126 (VJK), EY002687 an die Augenklinik und Visual Sciences an der Washington University unterstützt und von der Forschung zur Verhütung Blindheit.
Materials
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
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