Simultaneo<em> Ex vivo</em> Test funzionale di due retine per<em> In vivo</em> Sistema Elettroretinogramma
Summary
Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.
Abstract
An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.
Introduction
Elettroretinogramma (ERG) è una tecnica ben consolidata che può essere utilizzato per registrare l'attività elettrica della retina innescata dalla luce. Il segnale ERG è generato principalmente dalle variazioni di tensione causate da correnti radiali (lungo l'asse dei fotorecettori e cellule bipolari) scorre nello spazio extracellulare resistivo della retina. Il primo segnale ERG è stato registrato nel 1865 dal Holmgren dalla superficie di un occhio di pesce 1. Einthoven e Jolly 1908 2 diviso la risposta ERG all'insorgenza di luce in tre differenti onde, denominato a-, b-, e c-onde, che sono ormai noti per riflettere principalmente l'attività dei fotorecettori, cellule bipolari ON, e dell'epitelio pigmentato cellule, rispettivamente 3-8. ERG può essere registrato dagli occhi di animali o esseri umani (in vivo) anestetizzati, dalla preparazione isolato occhio 9, attraverso isolato retina intatto (ex vivo) 3,10-15 o attraverso strati della retina specifici con i microelettrodi (localeERG) 4,16. Di questi, in vivo ERG è attualmente il metodo più usato per valutare la funzione della retina. Si tratta di una tecnica non invasiva che può essere usato per scopi diagnostici o per seguire la progressione di malattie retiniche negli animali o pazienti. Tuttavia, in vivo registrazioni ERG producono un segnale complicato con diversi componenti sovrapposti, spesso contaminato da rumore extraocular fisiologico (ad esempio, la respirazione e l'attività cardiaca).
ERG locale può essere utilizzato per registrare il segnale attraverso strati specifici della retina ma è il più invasivo e ha il segnale-rumore più basso (SNR) rispetto alle altre configurazioni di registrazione ERG. ERG locale è anche tecnicamente impegnativo e richiede costose attrezzature (ad esempio, microscopio e micromanipolatori). Transretinal ERG dal intatto, isolato retina (ex vivo ERG) offre un compromesso tra in vivo e metodi ERG locali permettendo stabile e high SNR registrazioni da retine intatte di animali o esseri umani 17. Recentemente, questo metodo è stato utilizzato con successo per studiare l'asta e cono fotorecettori funzione in mammiferi, primati e umani retine 18-20. In aggiunta, a causa dell'assenza di dell'epitelio pigmentato in ex vivo retina, il componente c-onda positiva del segnale ERG viene rimosso e un componente importante negativo lento PIII è rivelato nelle ex vivo registrazioni. Il componente lenta PIII è stato dimostrato che provengono dalla attività delle cellule glia Müller nella retina 21-23. Così, ex vivo metodo ERG potrebbe essere utilizzato anche per studiare le cellule Müller nella retina intatto. Diversi studi hanno anche dimostrato che ex vivo registrazioni ERG potrebbero essere utilizzati per misurare la concentrazione di agenti farmacologici in giro per la retina 24 e testare la sicurezza e l'efficacia dei farmaci 25-27.
Commerciale multipla sistemi in vivo sono disponibili eutilizzato in molti laboratori che non hanno necessariamente vasta elettrofisiologia sfondo. Al contrario, ex vivo dispositivi non sono stati disponibili fino a poco 17 e come risultato solo pochi laboratori sono attualmente in corso vantaggio di questa tecnica potente. Sarebbe utile per effettuare registrazioni ex vivo ERG disponibile per più laboratori per far avanzare le nostre conoscenze sulla fisiologia della retina e la patologia, e di sviluppare nuove terapie per le malattie accecante. Dimostriamo qui un dispositivo semplice ed economico ex vivo ERG 17 e mostriamo come può essere utilizzato in combinazione con diversi sistemi disponibili in commercio in vivo ERG per registrare la segnalazione Rod- e cono-mediata (a- e b-onde) e la funzione di cellule Müller (lenta PIII) da intatte retine di topo wild-type.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dimostriamo qui i passaggi critici per l'ottenimento di alta qualità ex registrazioni vivo ERG contemporaneamente da due retine isolate del mouse utilizzando componenti in vivo del sistema ERG insieme ad un ex vivo adattatore ERG. In questo studio abbiamo perfusione entrambe le retine da animali con la stessa soluzione (sia Ames ', Locke o Ringer), ma è anche possibile perfusione ogni retina con una soluzione diversa per esempio, a scopo di test di droga. I pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni EY019312 e EY021126 (vjk), EY002687 al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive presso la Washington University, e da Research per prevenire la cecità.
Materials
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
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